310 10*1mm स्टेनलेस स्टील कोइल्ड ट्युबिङ रासायनिक कम्पोनेन्ट, स्पाइड्रोइनको एन-टर्मिनल डोमेनले एमाइलोइड फाइब्रिल्समा आधारित हाइड्रोजेल बनाउँछ र प्रोटीन स्थिरीकरणको लागि प्लेटफर्म प्रदान गर्दछ।

Nature.com भ्रमण गर्नुभएकोमा धन्यवाद।तपाईं सीमित CSS समर्थनको साथ ब्राउजर संस्करण प्रयोग गर्दै हुनुहुन्छ।उत्तम अनुभवको लागि, हामी तपाईंलाई अपडेट गरिएको ब्राउजर प्रयोग गर्न सिफारिस गर्छौं (वा इन्टरनेट एक्सप्लोररमा अनुकूलता मोड असक्षम गर्नुहोस्)।थप रूपमा, निरन्तर समर्थन सुनिश्चित गर्न, हामी शैलीहरू र जाभास्क्रिप्ट बिना साइट देखाउँछौं।
स्लाइडरहरू प्रति स्लाइड तीन लेखहरू देखाउँदै।स्लाइडहरू मार्फत सार्नको लागि पछाडि र अर्को बटनहरू प्रयोग गर्नुहोस्, वा प्रत्येक स्लाइडमा सार्नको लागि अन्तमा स्लाइड नियन्त्रक बटनहरू प्रयोग गर्नुहोस्।

विशिष्टता

310 10*1mm स्टेनलेस स्टील कोइल्ड ट्युबिंग आपूर्तिकर्ताहरू

रासायनिक संरचना

मेकानिकल गुणहरू

पुनः संयोजक स्पाइडर सिल्क प्रोटिनहरू (स्पाइडर रेशम प्रोटीनहरू) नयाँ बायोमटेरियलहरूको विकासमा धेरै सम्भावित अनुप्रयोगहरू छन्, तर तिनीहरूको बहुविध र एकीकरण-प्रवण प्रकृतिले तिनीहरूलाई प्राप्त गर्न गाह्रो र प्रयोग गर्न सजिलो बनाउँछ।यहाँ हामी रिपोर्ट गर्छौं कि पुन: संयोजक लघु स्पाइड्रोइन प्रोटीनहरू र, महत्त्वपूर्ण रूपमा, एन-टर्मिनल डोमेन (NT) आफैले द्रुत रूपमा 37 डिग्री सेल्सियसमा आत्म-समर्थन र पारदर्शी हाइड्रोजेलहरू बनाउँछ।NT र हरियो फ्लोरोसेन्ट प्रोटीन वा प्यूरिन न्यूक्लियोसाइड फस्फोरिलेज मिलेर बनेको फ्युजन प्रोटीन पूर्ण कार्यात्मक फ्युजन प्रोटीन बनाउँछ।हाइड्रोजेल।हाम्रा नतिजाहरूले देखाउँछन् कि पुन: संयोजक NT र फ्यूजन प्रोटीनहरूले उच्च अभिव्यक्ति उपज प्रदान गर्दछ र आकर्षक गुणहरू जस्तै पारदर्शिता, क्रसलिङ्किङ बिना जिलेसन, र उच्च घनत्वमा सक्रिय प्रोटीनहरूको प्रत्यक्ष स्थिरीकरण जस्ता आकर्षक गुणहरू प्रदान गर्दछ।
माकुराहरूसँग रेशम ग्रन्थिहरूका सातवटा विभिन्न सेटहरू हुन्छन्, प्रत्येकले एक विशिष्ट प्रकारको रेशम उत्पादन गर्दछ।सबै सात रेशम प्रजातिहरू स्पाइडर रेशम प्रोटीन (स्पिड्रोइन्स) लगभग 6000 अवशेषहरूबाट बनेका छन् र गोलाकार N- र C-टर्मिनल डोमेनहरू (NT र CT) 1,2 ले घेरिएको ठूलो केन्द्रीय दोहोरिने क्षेत्र समावेश गर्दछ।रेशमको सबैभन्दा व्यापक रूपमा अध्ययन गरिएको प्रकार, प्राथमिक एम्पुला, प्राथमिक एम्पुला ग्रंथि द्वारा उत्पादन गरिन्छ।यस ग्रंथिमा, एपिथेलियल कोशिकाहरूको एक मोनोलेयरले स्पाइड्रोइन प्रोटिनहरू संश्लेषित गर्दछ र तिनीहरूलाई ग्रंथिको लुमेनमा लुकाउँछ, जहाँ तिनीहरू अत्यधिक उच्च सांद्रतामा घुलनशील रूपमा (डोपिङ) मा उपस्थित हुन्छन् (30-50% w/v) 3,4।ग्रंथिमा मुख्य एम्पुलर स्पाइड्रोइन प्रोटीनहरूको संगठन र संरचनामा बहस गरिएको छ, तर धेरै प्रयोगात्मक प्रमाणहरूले सामान्यतया हेलिकल र/वा यादृच्छिक हेलिकल कन्फर्मेसन र माइकलर वा लेमेलर संरचनाहरू5,6,7,8,9,10 को उपस्थितिलाई संकेत गर्दछ।जबकि दोहोरिने डोमेनहरूले रेशम फाइबरको मेकानिकल गुणहरू विनियमित गर्दछ, β-शीट न्यानोक्रिस्टलहरू र अमोर्फस ढाँचाहरू 11,12,13,14,15 बनाउँछ, अन्तिम डोमेनहरूले रेशम ग्रन्थी 16,17,18 को साथमा परिवर्तन परिस्थितिहरूको प्रतिक्रियामा रेशम फाइबरलाई विनियमित गर्दछ।रेशम गठन नियन्त्रण गरेर, 19. टर्मिनल डोमेनहरू विकासवादी रूपमा संरक्षित छन् र तिनीहरूको कार्य सबै स्पाइड्रोइन प्रोटीनहरू 2,20,21 मा सामान्य हुन सक्छ।ग्रन्थी मार्फत जाने क्रममा, स्पाइड्रोइनको pH लगभग 7.6 देखि <5.716 सम्म घट्छ र क्रमशः साँघुरो नलिकाको माध्यमबाट चल्ने माध्यमबाट शियर र स्ट्रेचले बढ्छ।समाधानमा, CT एक α-हेलिकल संरचनात्मक समानान्तर dimer17 हो, तर कम pH र शियर बलहरूको प्रतिक्रियामा, CT ले β-layers16, 17 लाई खोल्छ र स्विच गर्दछ, सम्भवतः रूपान्तरण 16 को दोहोरिने क्षेत्रहरूमा β-तहहरूलाई ट्रिगर गर्दछ। NT अन्तर्गत मोनोमेरिक छन्। अवस्थाहरूले ग्रन्थीको लुमेनमा अवस्थाहरू प्रतिबिम्बित गर्दछ र स्पाइड्रोइनको घुलनशीलतालाई मध्यस्थता गर्दछ, तर कम pH मा, धेरै कार्बोक्सिलिक एसिड साइड चेनहरूको प्रोटोनेशनले लगभग 6.5 को pKa भएको NT को डाइमेराइजेसन निम्त्याउँछ, जसले गर्दा NT स्थिर हुन्छ र ठूलो मात्रामा स्पाइड्रोइन फिक्स गर्दछ। मात्राहरू।नेटवर्कहरू 16,18।यसरी, NT ले फिलामेन्ट गठनमा मुख्य भूमिका खेल्छ, कोटिंगमा मोनोमरबाट फाइबर23,24,25 मा डाइमरमा परिवर्तन हुन्छ।NT 16, 18, 19, 20, 26, 27, 28, 29 सम्म अध्ययन गरिएका सबै अवस्थाहरूमा अत्यधिक घुलनशील र हेलिकल रहन्छ, जसले हेटरोलगस प्रोटीनहरूको उत्पादनको लागि घुलनशीलता-बढाउने लेबलको रूपमा यसको विकासलाई प्रेरित गर्‍यो।
पुन: संयोजक मिनी स्पाइडर रेशम प्रोटिन, एक NT, एक छोटो दोहोरिने क्षेत्र, एक CT, र शुद्धीकरणको लागि His6 ट्याग (His-NT2RepCT) समावेश छ, जलीय बफरमा नेटिभ स्पाइडर रेशम प्रोटीन जत्तिकै घुलनशील छ र रेशम स्पाइडरको नेटिभ महत्त्वपूर्ण विशेषताहरूको नक्कल गर्दछ। ।कवरेज 25.31।His-NT2RepCT लाई बायोमिमेटिक मेसिन प्रयोग गरेर निरन्तर फाइबरमा कात्न सकिन्छ जसमा pH 8 घुलनशील कोटिंग pH 525,32,33,34,35 पानीको बाथमा निकालिन्छ।ई. कोलाईको बायोरिएक्टर किण्वनले His-NT2RepCT व्यक्त गर्दछ र पछिको उपचार पछि शुद्धीकरण पछि> 14 g/L उत्पादनमा परिणाम भयो।उच्च उपज, उच्च घुलनशीलता, र एसिडिक अवस्थाहरूमा His-NT2RepCT को पर्याप्त प्रतिक्रिया सबै NT23, 25, 34 मा जिम्मेवार छन्।
यहाँ हामीले 37 डिग्री सेल्सियसमा प्रोटिन घोल इन्क्युबट गरेर NT एक्लै लगायत रिकम्बिनेन्ट स्पाइड्रोइन प्रोटीनहरूबाट पारदर्शी हाइड्रोजेलहरूको द्रुत गठनको रिपोर्ट गर्छौं।थायोफ्लेभिन टी फ्लोरोसेन्स (ThT), फूरियर ट्रान्सफर्म इन्फ्रारेड स्पेक्ट्रोस्कोपी (FTIR), आणविक चुम्बकीय अनुनाद स्पेक्ट्रोस्कोपी (NMR) र ट्रान्समिशन इलेक्ट्रोन माइक्रोस्कोपी (TEM) को प्रयोग गरेर, हामीले NT र माइक्रोस्पाइडर प्रोटीनहरू β-sheets र amyloid-like fibr मा संरचनात्मक रूपान्तरणबाट गुज्रिरहेका भेट्टायौं। जब जेल बनाइन्छ।थप रूपमा, NT र हरियो फ्लोरोसेन्ट प्रोटीन (GFP) वा प्यूरिन न्यूक्लियोसाइड फस्फोरिलेज (PNP) को फ्यूजन प्रोटीनहरू पूर्ण रूपमा कार्यात्मक फ्यूजन टुक्राहरूसँग हाइड्रोजेलहरू बनाउँछन्।हेटरोलोगस होस्टहरूमा उच्च-थ्रुपुट अभिव्यक्ति, शारीरिक अवस्थाहरूमा हाइड्रोजेलहरूको द्रुत गठनको साथमा, इन्जिनियर गरिएको कार्यहरूको साथ हाइड्रोजेलहरूको लागत-प्रभावी उत्पादनको सम्भावना खोल्छ।
धेरै रिपोर्ट गरिएको पुन: संयोजक स्पाइड्रोइन प्रोटीन 36 विपरीत, His-NT2RepCT Tris-HCl बफरमा pH 8 मा स्थिर छ र वर्षा बिना 500 mg/mL सम्म केन्द्रित हुन सक्छ।तसर्थ, ३७ डिग्री सेल्सियस (चित्र १बी-डी) मा इन्क्युबेटेड हुँदा यो प्रोटिनले अप्टिकल रूपमा स्पष्ट, स्व-समर्थन गर्ने हाइड्रोजेलहरू द्रुत रूपमा बनाउँछ भन्ने कुरा पाउँदा हामी छक्क पर्यौं।थप अध्ययनहरूले देखाएको छ कि His-NT2RepCT गेलेसन प्रोटीन सांद्रता (10-300 mg/mL) को एक विस्तृत दायरामा भएको थियो र यो एकाग्रता gelation समय (Fig. 1c र पूरक Fig. 1) सँग उल्टो सम्बन्ध थियो।His-NT2RepCT को कुन भागहरूले हाइड्रोजेल गठनको मध्यस्थता गर्छ भनेर पत्ता लगाउन, हामीले प्रत्येक डोमेनलाई व्यक्तिगत रूपमा र विभिन्न संयोजनहरूमा फ्लास्क इन्भर्सन परख (चित्र 1a, b) प्रयोग गरेर जाँच गर्यौं।पुन: संयोजक स्पाइड्रोइनका सबै परीक्षण गरिएका अंशहरूले 1 घन्टा भन्दा कममा (300 mg/mL को प्रोटिन सांद्रतामा) जेल बनाइयो, अवक्षेपित 2Rep (चित्र 1b) बाहेक।यसले सुझाव दिन्छ कि NT र CT एक्लै, संयोजनमा, वा पुनरावृत्तिसँग सम्बन्धित, 37 ° C मा जेल हुन सक्छ र His6 ट्यागले यस प्रक्रियालाई कुनै पनि महत्त्वपूर्ण हदसम्म असर गर्दैन।NT एक अत्यधिक घुलनशील र स्थिर प्रोटीन हो भन्ने सामान्य धारणालाई ध्यानमा राख्दै, र पुन: संयोजक स्पाइड्रोइन हाइड्रोजेलको अघिल्लो रिपोर्टहरूले दोहोरिने क्षेत्रहरू र/वा सीटीहरूमा परिवर्तनीय परिवर्तनहरूमा गेलेसन प्रभावहरूलाई श्रेय दिएको छ, NT आफैले गर्न सक्छ।जेलेसनको खोज अप्रत्याशित थियो।पूरक तालिका 1) 37, 38, 39। उल्लेखनीय रूपमा, NT पहिले नै 10 मिनेट भित्र ≥ 300 mg/mL (चित्र 1c) को एकाग्रतामा जेलिएको छ।NT को विभिन्न सांद्रताका साथ भायल इन्वर्सन प्रयोगहरूले देखायो कि> 50 mg/mL मा NT समाधान सम्बन्धित एकाग्रतामा His-NT2RepCT भन्दा छिटो हुन्छ (w/v, चित्र 1c)।
यस कार्यमा अध्ययन गरिएका विभिन्न स्पाइड्रोइन निर्माणहरूको योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व।b जेल समय 37 °C मा विभिन्न पुनः संयोजक स्पाइड्रोइन प्रोटीन (300 mg/mL) को लागि शीशी उल्टो गरेर प्रमाणित।इन्क्युबेशन बिना तुरुन्तै CT जेल (<300 mg/mL), 2Rep precipitates (300 mg/mL, 5 mm स्केल)।c His-NT2RepCT र NT को जेल समय 37 डिग्री सेल्सियसमा संकेत गरिएको प्रोटीन सांद्रतामा।d स्पाइडर र तल मुद्रित अक्षर "NT" सहितको His-NT2RepCT र NT हाइड्रोजेलका फोटोहरू क्रमशः (दुवै 200 mg/mL, स्केल बार 5 mm)।
विभिन्न पुनः संयोजक स्पाइड्रोइन प्रोटीनहरूद्वारा बनाइएका हाइड्रोजेलहरू अलि फरक रङहरू हुन्छन्, र नाङ्गो आँखाको अवलोकनले पारदर्शिताको फरक-फरक डिग्री देखाउँछ (चित्र 1b)।NT जेलहरू असाधारण रूपमा स्पष्ट हुन्छन् जबकि अन्य जेलहरू अपारदर्शी हुन्छन्।बेलनाकार ट्यूबहरूमा फ्याँकिएका His-NT2RepCT र NT जेलहरू मोल्ड अक्षुण्ण (चित्र 1d) बाट हटाउन सकिन्छ।
प्राकृतिक माकुरा रेशम कोटिंग्स जेलले परिस्थितिमा अब पुन: संयोजक स्पाइड्रोइन प्रोटिनको गेलेसन निम्त्याउँछ कि भनेर परीक्षण गर्न, स्वीडिश ब्रिज स्पाइडर (Larinioides sclopetarius) को ठूलो एम्पुला ग्रन्थीबाट कोटिंग्स संकलन गरिएको थियो।कोटिंग्स 20 mM Tris-HCl बफरमा 50 mg/mL (मापन गरिएको सुख्खा तौलमा आधारित) मा भण्डारण गरिएको थियो, तर 37 °C (पूरक चित्र 2a) मा 21 दिनको इन्क्युबेशनको समयमा कुनै गेलेसन अवलोकन गरिएको थिएन।
यी gels मापन गर्न, rheological मापन gelation प्रक्रिया अध्ययन गर्न र समग्र मेकानिकल गुणहरू निर्धारण गर्न प्रयोग गर्न सकिन्छ।विशेष गरी, उच्च तापमानमा भण्डारण मोड्युलस (लोचकता) को निगरानीले gelling तापमान साथै कोटिंग को viscoelastic गुण मा जानकारी प्रदान गर्न सक्छ।तापक्रम वृद्धि प्रयोगहरू (प्राकृतिक रेशम स्टक समाधानहरू प्रयोग गरेर अघिल्लो अध्ययनहरूमा आधारित 1°C/min 25-45°C मा) 40,41 ले देखाएको छ कि His-NT2RepCT र NT समाधानहरूको भण्डारण मोड्युली बढ्दो तापक्रमसँगै बढेको छ।बढेको थियो (चित्र २ र पूरक चित्र ३)।उल्लेखनीय रूपमा, NT मोड्युल His-NT2RepCT को तुलनामा कम तापक्रममा बढ्न थाल्यो, NT लाई प्रत्यक्ष रूपमा His-NT2RepCT सँग 37°C (चित्र 1) मा इन्क्युबेटेड गर्दा देखाइएको छिटो जेल समयसँग अनुरूप।तापक्रममा पछिल्ला गिरावट पछि, भण्डारण मोडुलस कम मानहरूमा फर्किएन र हानि मोड्युलस भन्दा माथि रह्यो (पूरक चित्र 3 हेर्नुहोस्), थर्मल रूपमा अपरिवर्तनीय स्थिर गेलेसनलाई संकेत गर्दै।जेलेसन पछि, अन्तिम लोचदार मोड्युलस His-NT2RepCT हाइड्रोजेलका लागि 15 देखि 330 kPa 100-500 mg/mL को एकाग्रतामा, र NT हाइड्रोजेलहरू (100-500 mg/mL) को लागि अन्तिम लोचदार मोड्युलस 200 देखि 2041 सम्मको थियो। kPa (चित्र, 2 र पूरा र्‍याम्प डेटा) पूरक चित्र 3 हेर्नुहोस्)।
हिस-NT2RepCT (300 mg/mL) र b NT (300 mg/mL) काँप्ने क्रममा तापमानमा परिवर्तन।तीरहरूले तापमान प्रवृत्तिलाई संकेत गर्दछ, र भण्डारण मोड्युल डेटाको हल्का छायांकनले निर्माताले तोकिएको भन्दा कम टर्क मानहरूमा परीक्षण चित्रण गर्दछ, जुन बढेको आवाजको कारण हो।c उच्च तापमान (100, 300, र 500 mg/mL) पछि His-NT2RepCT र NT को अन्तिम मोड्युल संचय।सबै मोड्युल पढाइहरू 0.1 Hz को आवृत्तिमा लिइन्छ।
जेलेसनसँग सम्बन्धित संरचनात्मक परिवर्तनहरूको अनुसन्धानको लागि सम्भावित विधिको रूपमा, हामीले 37 ° C (चित्र 3a, b) मा gelation अघि र पछि His-NT2RepCT र NT को FTIR स्पेक्ट्रा रेकर्ड गर्यौं।अपेक्षित रूपमा, His-NT2RepCT र NT समाधानहरूको स्पेक्ट्राले α-helix/random coil माध्यमिक संरचना देखाउने प्रोटिनसँग मेल खान्छ, 1645 cm-1 मा स्पष्ट ब्यान्डको साथ।दुबै हाइड्रोजेलहरूका लागि, जेलेसनको परिणामस्वरूप मध्य I ब्यान्डमा लगभग 1617 सेमी-1 र 1695 सेमी-1 (चित्र 3a, b) मा दुईवटा हातहरू बनाइयो, जसले समानान्तर β-पाना संरचनाहरूको गठनलाई संकेत गर्दछ।यी परिवर्तनहरू सम्बन्धित दोस्रो व्युत्पन्न र भिन्नता जेलेसन स्पेक्ट्रा (पूरक चित्र 4b) मा पनि स्पष्ट रूपमा देख्न सकिन्छ।NT β-तहका दुई ब्यान्डहरू His-NT2RepCT को भन्दा बढी स्पष्ट थिए, यसले संकेत गर्दछ कि NT हाइड्रोजेलमा β-लेयर ब्यान्डहरूको कुल सामग्री NT2RepCT हाइड्रोजेलको भन्दा बढी थियो।
His-NT2RepCT र b NT (दुबै 500 mg/mL) को FTIR अवशोषण स्पेक्ट्रा (समाधान) अघि र (जेल) 37 डिग्री सेल्सियसमा इन्क्युबेशन पछि।c पुन: निलम्बित 50 mg/ml NT2RepCT gels र d NT को TEM छविहरू।स्केल बार 200 एनएम।ई His-NT2RepCT र NT हाइड्रोजेलको फाइबर व्यास।n = 100 मापन गरिएको फाइब्रिल्स, p <0.0001।त्रुटि पट्टीहरूले मानक विचलन देखाउँछन्।त्रुटि पट्टीहरूको केन्द्र औसत हो।एक unpaired t-परीक्षण (दुई पुच्छर) सांख्यिकीय विश्लेषण को लागी प्रयोग गरिएको थियो।f विभिन्न पुन: संयोजक स्पाइड्रोइन प्रोटिनहरूको ThT प्रतिदीप्ति (100 mg/mL) 37 °C मा बिना हल्लाई।g NT (100 mg/mL) 0%, 5%, 10%, र 20% बीजको साथ 100 mg/mL NT जेलबाट टीकाकरण प्रयोगहरू।
ट्रान्समिशन इलेक्ट्रोन माइक्रोस्कोपी (TEM) को प्रयोग गरी जेलको विश्लेषणले हाइड्रोजेलमा एमाइलोइड-जस्तो फाइब्रिल्स (फिग्स। 3c, 3d) समावेश भएको देखाएको छ।NT-गठित फाइब्रिलहरू लामो (5–12 nm व्यासमा) र शाखारहित थिए, जबकि His-NT2RepCT फाइब्रिलहरू लम्बाइमा छोटो र व्यासमा उल्लेखनीय रूपमा फराकिलो थिए (7-16 nm) (चित्र 3e)।यी नतिजाहरूले हामीलाई थिओफ्लेभिन T (ThT) परख प्रयोग गरेर फाइब्रोसिसको गतिविज्ञान पछ्याउन अनुमति दियो।सबै पुन: संयोजक स्पाइड्रोइन प्रोटिनहरूका लागि, नमूनाहरू ३७ °C मा इन्क्युबेटेड हुँदा फ्लोरोसेन्ट सङ्केत बढ्यो (चित्र 3f, पूरक चित्र 5a)।यस खोजसँग मिल्दोजुल्दो, NT र His-NT2RepCT को माइक्रोस्कोपिक परीक्षणले gelling परिस्थितिहरूमा ThT-सकारात्मक समुच्चयहरू (पूरक चित्र 5b,c) को स्थानीय संचय बिना ThT प्रतिदीप्तिमा एक समान वृद्धि प्रकट गर्‍यो।ThT-positive fibrils को गठन NT र His-NTCT टर्बिडिटी (पूरक चित्र 5d) मा वृद्धि संग थिएन, जसको मतलब जेल मा फाइब्रिल को नेटवर्क जेल स्पष्टता संग सम्झौता बिना गठन गर्न सक्छ।थोरै मात्रामा पूर्व-गठित फाइब्रिलहरू थपेर रोप्दा केही एमाइलोइडहरू 42,43,44 को फाइब्रिल गठनलाई उल्लेखनीय रूपमा गति दिन सक्छ तर NT हाइड्रोकोआगुलेन्टको घोलमा 5%, 10% वा 20% (w/w) NT थप्दा।रोपण प्रभाव (चित्र 3 ग्राम)।सायद यो हाइड्रोजेल मा fibrils अपेक्षाकृत निश्चित छ र बीउ को रूप मा प्रयोग गर्न सकिदैन भन्ने तथ्य को कारण हो।
उच्च तापमानमा पुन: संयोजक स्पाइड्रोइन प्रोटीनहरूको अप्रत्याशित व्यवहारले जेल गठनसँग सम्बन्धित संरचनात्मक परिवर्तनहरू पहिचान गर्न थप परमाणु चुम्बकीय अनुनाद (NMR) स्पेक्ट्रोस्कोपी अध्ययनहरूलाई प्रेरित गर्‍यो।37 डिग्री सेल्सियसमा समयको साथ रेकर्ड गरिएको His-NT2RepCT समाधानहरूको NMR स्पेक्ट्राले CT अझै आंशिक रूपमा फोल्ड गरिएको देखाएको छ, जबकि NT र 2Rep संकेतहरू गायब भएका छन् (चित्र 4a), सुझाव दिन्छ कि यो मुख्यतया NT र 2Rep थियो जसले आंशिक रूपमा हिस-को गठनलाई नियन्त्रण गर्दछ। NT2RepCT हाइड्रोजेल।CT सिग्नल पनि यसको मूल तीव्रताको 20% मा कम गरिएको थियो, सुझाव दिन्छ कि CT पनि प्रायः स्थिर र हाइड्रोजेल संरचनामा समावेश गरिएको छ।CT को सानो भागको लागि, जुन प्रिइन्क्युबेटेड नमूनामा जस्तै मोबाइल छ र यसरी समाधान NMR द्वारा अवलोकन गरिएको छ, स्पेक्ट्रामा पहिलो 10 संरचित अवशेषहरूको लागि संकेतहरूको अभाव छ, सम्भवतः His-NT2Rep को संलग्न भागको कठिन स्थिरताको कारणले।हाइड्रोजेलको -स्टेट -NT2RepCT को NMR स्पेक्ट्राले α-helices र β-लेयरहरूको प्रमुख उपस्थिति प्रकट गर्‍यो र, केही हदसम्म, अनियमित कुण्डल संरचना (चित्र 4b)।केवल NT मा उपस्थित methionine अवशेषहरूको रासायनिक शिफ्ट विश्लेषणले देखायो कि यो डोमेन β-शीट संरचनामा रूपान्तरण गरिएको थियो।समाधानमा NT को समय-निर्भर स्पेक्ट्राले संकेत तीव्रता (चित्र 4c) मा एक समान कमी देखायो, र NT हाइड्रोजेलको ठोस-स्थिति NMR ले देखायो कि अधिकांश NT अवशेषहरू β-पाना संरचनाहरूमा रूपान्तरण गरिएको थियो (चित्र 4d)।2Rep को रूपान्तरण यसको समग्रताको कारणले छुट्टै निर्धारण गर्न सकिँदैन।यद्यपि, NTCT र His-NT2RepCT हाइड्रोजेलको ठोस अवस्था NMR स्पेक्ट्रा धेरै समान देखिन्थ्यो (चित्र 4b; पूरक चित्र 6b), सुझाव दिन्छ कि 2Rep ले His-NT2RepCT हाइड्रोजेलको संरचनात्मक भागमा थोरै योगदान पुर्‍यायो।CT hydrogels को लागि, α-helices, β-sheets, र अनियमित हेलिकल माध्यमिक संरचनाहरू अवस्थित फेला परे (पूरक चित्र। 6d)।यसले सुझाव दिन्छ कि CT को केहि भागहरू α-helices रहन्छन् जबकि अन्य β-पानाहरू हुन्छन्।यसरी, NMR स्पेक्ट्रोस्कोपीको नतिजाले सुझाव दिन्छ कि NT हाइड्रोजेल गठनको लागि महत्त्वपूर्ण छ र 2Rep र CT सँग फ्युजनमा β-शीट कन्फर्मेसनमा पनि रूपान्तरण हुन्छ।यससँग मिल्दोजुल्दो, हामीले भर्खरै पत्ता लगायौं कि एमाइलाइड स्पेसियल जिपरहरू NT डोमेनका सबै पाँच हेलिकहरूमा बन्न सक्छ, र वाल्ट्ज एल्गोरिथ्मले हेलिक्स 1 (चित्र 4e) मा एक एमाइलाइडोजेनिक क्षेत्रको भविष्यवाणी गरेको छ।
15N-HSQC को 2D स्पेक्ट्रा 10 mg/mL His-NT2RepCT समाधान अघि (नीलो) र 37 डिग्री सेल्सियस मा इन्क्युबेशन (रातो) पछि 19 घण्टा।रातो स्पेक्ट्रममा व्यक्तिगत क्रस पीकहरू र नीलो स्पेक्ट्रममा F24, G136, polyA एकल अक्षर एमिनो एसिड प्रतीकहरू र अवशेष संख्याहरू द्वारा जनाइएको छ।इनसेटहरूले NT, 2Rep, र CT डोमेनहरूबाट चयन गरिएका अवशेषहरूको लागि समयमै सिग्नल तीव्रताको निर्भरता देखाउँछन्।b His-NT2RepCT हाइड्रोजेलको ठोस-राज्य रेडियो फ्रिक्वेन्सी (RFDR) स्पेक्ट्रा।RFDR स्पेक्ट्रामा अवलोकन गरिएका Cα/Cβ अवशेषहरूको सहसंबंधहरू मोडेल पेप्टाइड रासायनिक परिवर्तनहरू र तथ्याङ्कहरू 82,83 र तिनीहरूको माध्यमिक संरचनाहरूबाट व्युत्पन्न मानहरूसँग तुलना गरेर निर्धारण गरिएको थियो।SSB - घुमाउने साइडब्यान्ड।c 15N-HSQC 10 mg/mL NT समाधानको एक-आयामी स्पेक्ट्रा 37 °C मा 36 घण्टाको लागि इन्क्युबेशनको समयमा।इन्सेटले समयको तुलनामा भोल्युमेट्रिक तीव्रता देखाउँछ।d NT हाइड्रोजेलको ठोस अवस्था RFDR स्पेक्ट्रा।Cα/Cβ अवशेषहरूको सहसंबंध र RFDR स्पेक्ट्रामा अवलोकन गरिएका तिनीहरूको माध्यमिक संरचनाहरू संकेत गरिएका छन्।जिपर डाटाबेस (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/) बाट NT45.79 फाइब्रिलेसन प्रोपेन्सिटी प्रोफाइलमा आधारित।हेक्सापेप्टाइडको स्थानिय बिजुली सिफ्ट विन्डोको रोजेटा ऊर्जा kcal/mol मा देखाइएको छ।रातो पट्टीहरूले उच्च फाइब्रोसिस प्रवृत्तिका साथ हेक्सापेप्टाइडहरूलाई जनाउँछ (रोसेटा ऊर्जा -23 kcal/mol तल; बिन्दु रेखा मुनि)।हरियो पट्टीहरूले थ्रेसहोल्डभन्दा माथिको रोसेटा ऊर्जा भएका टुक्राहरूलाई संकेत गर्छ र त्यसैले स्टेरिक जिपरहरू बन्ने सम्भावना कम हुन्छ।प्रोलाइन युक्त टुक्राहरू विश्लेषणबाट बहिष्कृत गरियो (स्तम्भहरू बिना)।वर्गहरूले वाल्ट्ज एल्गोरिथ्म81 (https://waltz.switchlab.org) द्वारा भविष्यवाणी गरिएको एमाइलोइडोसिसका क्षेत्रहरूलाई संकेत गर्दछ।NT को एमिनो एसिड अवशेषहरूको अनुक्रम शीर्षमा छ, र β माध्यमिक संरचना (ठोस-राज्य NMR स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा निर्धारित) मा पाइने अवशेषहरूको प्रकार रातो रंगमा देखाइएको छ।पाँच NT α-helices को स्थिति (H1-H5) 28 को रूपमा नामित गरिएको छ।
pH <6.5 मा, HT dimerizes, गर्मी- वा ​​यूरिया-प्रेरित विकृतीकरण 18 प्रतिरोधी भएर।NT dimerization र स्थायित्वले gelation लाई कसरी असर गर्छ भनेर स्पष्ट गर्न, 100 mg/ml NT युक्त समाधानहरू pH 8, 7, र 6 मा शीशी उल्टो परीक्षण प्रयोग गरेर नियन्त्रण गरियो।NT नमूनाहरू pH 8 र 7 मा 30 मिनेट पछि 37 °C मा इन्क्युबेटेड, तर pH 8 जेल स्पष्ट रह्यो, जबकि pH 7 जेलले दृश्यात्मक अवक्षेपण देखायो (चित्र 5a)।यसको विपरित, pH 6 मा HT भएको समाधानले जेल बनाउँदैन, र 37 डिग्री सेल्सियसमा 20 मिनेट पछि ठूलो अवक्षेपण देख्न सकिन्छ।यसले सुझाव दिन्छ कि डाइमरहरू आफैं र/वा मोनोमरहरूको तुलनामा तिनीहरूको उच्च स्थिरताले गेलेसनलाई रोक्छ।pH 7 र 6 मा NT को लागि अवक्षेपणको गठन अपेक्षित थिएन, किनकि यो रिपोर्ट गरिएको छ कि NT 200 mg/ml27 मा घुलनशील छ, तातो विकृति पछि सजिलै पुन: फोल्ड हुन्छ, र निम्न मानहरूमा α-हेलिक्स पनि राख्छ। pH 18. यी विसंगतिहरूको लागि एक सम्भावित व्याख्या यो हो कि पहिले रिपोर्ट गरिएका प्रयोगहरू कोठाको तापक्रममा वा तल, वा अपेक्षाकृत कम प्रोटीन सांद्रतामा 16,18,19 मा गरिएको थियो।
NT शीशी उल्टो परीक्षण (100 mg/mL) pH 8, 7, 6 र 154 mM NaCl (pH 8) 37 डिग्री सेल्सियसमा इन्क्युबेशन पछि।b NT CD स्पेक्ट्रा 154 mM NaF र 154 mM NaCl बिना र बिना।222 nm मा मोलर अण्डाकार प्राकृतिक तहको अनुपातमा रूपान्तरण हुन्छ।c NT इन्भर्सन परख (100 mg/mL) NT* (37 °C र 60 °C), NTA72R (37 °C), र His-NT-L6 (37 °C र 60 °C)।d NT mutants NT*, NTA72R, र His-NT-L6 को CD स्पेक्ट्रा।222 nm मा मोलर अण्डाकार प्राकृतिक तहको अनुपातमा रूपान्तरण हुन्छ।e NTFlSp, NTMiSp र घटाइएको NTMiSp (100 mg/mL) को उल्टो परीक्षण।स्केल बार 5 मिमी।f NT को CD स्पेक्ट्रा, NTFlSp, NTMiSp र घटाइएको NTMiSp।222 nm मा मोलर अण्डाकार प्राकृतिक तहको अनुपातमा रूपान्तरण हुन्छ।पूर्ण NT स्पेक्ट्रा 25 ° C र 95 ° C मा पूरक चित्र 8 मा देखाइएको छ।
शारीरिक नुन एकाग्रताले NT सबयुनिटहरू बीचको इलेक्ट्रोस्ट्याटिक अन्तरक्रियाहरू र कम pH18 मा NT स्थानान्तरणको dimerization निर्धारण गर्दछ।हामीले पत्ता लगायौं कि 154 mM NaCl र NaF को उपस्थितिले क्रमशः जिलेसनलाई रोकेको छ (चित्र 5a, b; पूरक चित्र 2b) र यी लवणहरूले NT मोनोमरहरूको थर्मल स्थिरता बढायो (चित्र 5b, पूरक चित्र। 8)। ।यसले यो पनि सुझाव दिन्छ कि स्थिरता वृद्धि, dimerization को सट्टा, जेल गठन रोक्छ।
प्रोटिन डाइमेराइजेसन र जेलेसनमा स्थिरताको भूमिकालाई थप अन्वेषण गर्न, हामीले दुई म्युटेन्टहरू, NT* र NTA72R प्रयोग गर्यौं, जुन कम pH28.30 मा पनि मोनोमेरिक रहन्छ।NT* एक डबल चार्ज रिभर्सल म्युटेन्ट हो जसमा मोनोमरको स्पष्ट द्विध्रुवीय चार्ज वितरण सपाट हुन्छ, जसले डाइमेराइजेसनलाई रोक्छ र मोनोमर स्थिरतालाई तीव्र रूपमा बढाउँछ।NTA72R एक चार्ज गरिएको द्विध्रुव हो, तर Arg-substituted Ala dimer सीमामा अवस्थित छ, त्यसैले उत्परिवर्तनले dimerization को लागि आवश्यक subunit अन्तरक्रियाहरूमा हस्तक्षेप गर्दछ।३७°C मा इन्क्युबेशन गर्दा, NT* ले हाइड्रोजेल बनाउँदैन, जबकि NTA72R ले १५ मिनेटको लागि अपारदर्शी जेल बनायो (चित्र 5c)।NT* र NTA72R दुबै डाइमराइज गर्न नसकिने तर मोनोमर स्थिरता (चित्र 5d) मा फरक भएको हुनाले, यी नतिजाहरूले उच्च थर्मोडायनामिक स्थिरताले NT लाई gelling हुनबाट रोक्छ भनेर दृढतापूर्वक सुझाव दिन्छ।यो तथ्यले पनि समर्थन गर्दछ कि HT* ले जेल बनाउँछ जब यो उच्च तापक्रममा अस्थिर हुन्छ (8 मिनेट पछि 60°C; चित्र 5c)।यो पहिले देखाइएको छ कि NT मा methionine को उच्च सामग्री यसको प्राकृतिक तह तरल बनाउँछ र छ मेट टु Leu विकल्पहरू (यहाँ His-NT-L6 को रूपमा उल्लेख गरिएको छ) NT46 मोनोमरलाई दृढतापूर्वक स्थिर बनाउँछ।NT जेल गठनको लागि संरचनात्मक लचिलोपन आवश्यक छ भन्ने धारणाको आधारमा, हामीले पत्ता लगायौं कि His-NT-L6 स्थिर उत्परिवर्तीले 37 ° C मा जेल गरेन (चित्र 5c, d)।यद्यपि, His-NT-L6 ले ६० मिनेट (चित्र 5c) को लागि 60°C मा इन्क्युबेशनमा जेल पनि बनायो।
NT को β-पाना संरचनाहरूमा रूपान्तरण गर्न र हाइड्रोजेलहरू बनाउन सक्ने क्षमता स्पाइड्रोइनको सबै NT डोमेनहरूमा लागू हुने देखिन्छ।विभिन्न रेशम प्रकारहरू र माकुरा प्रजातिहरूका NTs, Trichonephila clavipes (NTFlSp), तिनीहरूको तुलनात्मक रूपमा कम मेथियोनिन सामग्री र उच्च थर्मल स्थिरता (चित्र 5e, f र पूरक तालिका 2) को बावजुद जेल बने।यसको विपरित, कम थर्मल स्थिरता र उच्च मेथियोनाइन सामग्रीको साथ एरेनियस भेन्ट्रिकोसस (NTMiSp) बाट सानो एम्पुलर प्रोटीन स्पाइड्रोइनबाट NT ले हाइड्रोजेल बनाउँदैन (पूरक तालिका 2 र चित्र 5e, f)।पछिल्लो intramolecular डाइसल्फाइड बन्ड 29,47 को उपस्थिति संग सम्बन्धित हुन सक्छ।लगातार, जब NTMiSp को डाइसल्फाइड बन्डहरू घटाइयो, यसले 10 मिनेट (चित्र 5e) को लागि 37 डिग्री सेल्सियसमा इन्क्युबेशन पछि हाइड्रोजेल बनायो।अन्तमा, यो ध्यान दिनु पर्छ कि संरचनात्मक लचिलोपन एक महत्त्वपूर्ण छ, तर मात्र होइन, NT बाट जेलको गठनको लागि मापदण्ड।सान्दर्भिक हुनसक्ने अर्को कारक भनेको एमाइलोइड फाइब्रिलहरू बन्ने प्रवृत्ति हो, र जिपर डाटाबेस र वाल्ट्ज एल्गोरिदमको विश्लेषणले जेलहरू बनाउन सक्ने क्षमता र एमाइलोइडोजेनिक क्षेत्रहरूको उपस्थिति, साथै भविष्यवाणी गरिएको क्षेत्रहरूको सीमा बीचको सम्बन्ध देखाएको छ। स्टेरिक जिपरहरू बनाउन।त्यहाँ एक सम्बन्ध थियो (पूरक तालिका 2 र पूरक चित्र। 9)।
NT को फाइब्रिलहरू बनाउन र अनुकूल परिस्थितिहरूमा जेलहरू बनाउनको क्षमताले हामीलाई अन्य प्रोटीन टुक्राहरूसँग NT फ्युजनले फ्यूजन साझेदारहरूको पूर्ण कार्यको साथ जेलहरू बनाउन सक्छ भन्ने परिकल्पना गर्न नेतृत्व गर्‍यो।यो परीक्षण गर्न, हामीले NT को C-टर्मिनसमा क्रमशः हरियो फ्लोरोसेन्ट प्रोटीन (GFP) र प्यूरिन न्यूक्लियोसाइड फस्फोरिलेज (PNP) प्रस्तुत गर्यौं।परिणामित फ्युजन प्रोटीनहरू E. coli मा धेरै उच्च अन्तिम उपज (हिस-NT-GFP र His-NT-PNP को लागि क्रमशः 150 mg/L र 256 mg/L शेक फ्लास्क कल्चरहरू) मा व्यक्त गरिएको थियो, के देखाइएको छ। NT Ref मा फ्युज गरिएका अन्य प्रोटीनहरूको लागि।30. His-NT-GFP (300mg/mL) र His-NT-PNP (100mg/mL) फ्युजन प्रोटीनले 2 घण्टा र 6.5 घन्टा पछि 37°C मा जेल बनायो र, महत्त्वपूर्ण कुरा, GFP अंश अपरिवर्तित रह्यो।जिलेसन पछि अवलोकन गरिएको, प्रारम्भिक प्रतिदीप्ति तीव्रताको> 70% गेलेसन पछि बाँकी रहेको (चित्र 6a)।उसको-NT-PNP समाधानहरू र जेलहरूमा PNP गतिविधि मापन गर्न, हामीले NT सँग फ्युजन प्रोटीन पातलो गर्नुपर्‍यो किनभने शुद्ध तयारीको इन्जाइम्याटिक गतिविधि जेलिङ सांद्रतामा परखको पत्ता लगाउने दायरा बाहिर थियो।०.०१ mg/mL His-NT-PNP र 100 mg/mL NT भएको मिश्रणले बनेको जेलले प्रिइन्क्युबेटेड नमूनाहरूको प्रारम्भिक इन्जाइम्याटिक गतिविधिको 65% कायम राख्यो (चित्र 6b)।मापनको समयमा जेल अक्षुण्ण रह्यो (पूरक चित्र। 10)।
His-NT-GFP (300 mg/mL) को gelation अघि र पछि सापेक्ष प्रतिदीप्ति तीव्रता र His-NT-GFP हाइड्रोजेल (300 mg/mL) देखिने र UV प्रकाश अन्तर्गत उल्टो शीशी।बिन्दुहरूले व्यक्तिगत मापन देखाउँछन् (n = 3), त्रुटि बारहरूले मानक विचलन देखाउँछन्।औसत मान त्रुटि पट्टीहरूको केन्द्रमा देखाइएको छ।b PNP गतिविधि NT (100 mg/ml) र 0.01 mg/ml his-NT-PNP र 100 mg/ml नयाँ ताइवान डलर समावेश भएको समाधान र जेलहरू प्रयोग गरेर फ्लोरोमेट्रिक विश्लेषणद्वारा प्राप्त गरिएको थियो।इन्सेटले His-NT-PNP (5 mm स्केल बार) युक्त हाइड्रोजेल भएको उल्टो शीशी देखाउँछ।
यहाँ, हामी NT र अन्य पुन: संयोजक स्पाइड्रोइन प्रोटीनहरूबाट 37 डिग्री सेल्सियस (चित्र 1) मा प्रोटीन समाधान इन्क्युबट गरेर हाइड्रोजेलहरूको गठन रिपोर्ट गर्छौं।हामीले देखाउँछौं कि gelation α-helices को β-layers मा रूपान्तरण र amyloid-like fibrils (Figs. 3 र 4) को गठन संग सम्बन्धित छ।यो खोज अचम्मको छ किनकि NTs कुण्डल गरिएको ग्लोबुलर पाँच-हेलिक्स बन्डलहरू हुन् जुन तिनीहरूको अत्यधिक उच्च घुलनशीलता र सांद्रतामा 200 mg/mL 4°C मा धेरै दिनसम्म उच्च स्थिरताका लागि परिचित छन्।थप रूपमा, एनटीहरू µM मा कम प्रोटीन सांद्रतामा तातो विकृति पछि सजिलै पुन: फोल्ड हुन्छन्।हाम्रा नतिजाहरूका अनुसार, फाइब्रिल गठनको लागि >10 mg/mL प्रोटीन एकाग्रता र थोरै बढेको तापक्रम (चित्र 1) को संयोजन चाहिन्छ।यो विचार संग संगत छ कि amyloid fibrils globularly folded प्रोटीनहरु बाट बन्न सक्छ जुन शारीरिक अवस्था 48 अन्तर्गत थर्मल उतार-चढ़ावको कारण आंशिक रूपमा खुला अवस्थामा छन्।यस रूपान्तरणबाट गुज्रने प्रोटीनहरूको उदाहरणहरूमा इन्सुलिन 49,50, β2-माइक्रोग्लोबुलिन, ट्रान्सथाइरेटिन र लाइसोजाइम 51,52,53 समावेश छन्।यद्यपि NT यसको मूल स्थितिमा α-हेलिक्स हो, लगभग 65% पोलीपेप्टाइड चेन स्टेरिक जिपर गठन (चित्र 4e) 45 सँग उपयुक्त छ।मोनोमर गतिशील रूपमा मोबाइल ४६ भएको हुनाले, यसले यी सम्भावित एमाइलाइडोजेनिक क्षेत्रहरूलाई मध्यम स्तरको तापक्रममा उजागर गर्न सक्छ र कुल प्रोटिनको उच्च सांद्रतामा एमाइलोइड फाइब्रिल गठनको लागि महत्वपूर्ण एकाग्रतामा पुग्न सक्छ।यस तर्कलाई पछ्याउँदै, हामीले स्पाइड्रोइन एकाग्रता र गेलेसन समय (चित्र 1c) बीचको नकारात्मक सम्बन्ध फेला पार्यौं, र यदि मोनोमेरिक NT कन्फर्मेसन या त उत्परिवर्तन (NT*, His-NT-L6) वा नुन थपेर स्थिर हुन्छ भने, यसले रोक्न सक्छ। गठन हाइड्रोजेल (चित्र 5)।
धेरैजसो अवस्थामा, amyloid fibrils एक अवक्षेपणको रूपमा घोलबाट गायब हुन्छ, तर निश्चित परिस्थितिहरूमा तिनीहरूले हाइड्रोजेलहरू 55,56,57 बनाउन सक्छन्।हाइड्रोजेल-बनाउने फाइब्रिलहरूसँग सामान्यतया उच्च पक्ष अनुपात हुन्छ र आणविक उलझन मार्फत स्थिर त्रि-आयामी नेटवर्कहरू बनाउँछ, 55,58 हाम्रो परिणामहरूसँग अनुरूप।भिट्रोमा हाइड्रोजेल गठनको लागि, प्रोटिनहरू प्रायः पूर्ण वा आंशिक रूपमा प्रकट हुन्छन्, उदाहरणका लागि, जैविक विलायकहरू, उच्च तापक्रम (७०–९० डिग्री सेल्सियस) र/वा कम pH (१.५–३.०) ५९,६०,६१,६२ को जोखिमबाट।यहाँ वर्णन गरिएका स्पाइड्रोइन हाइड्रोजेलहरूलाई कठोर प्रशोधन आवश्यक पर्दैन, न त उनीहरूलाई हाइड्रोजेलहरू स्थिर गर्न क्रस-लिङ्किङ एजेन्टहरू चाहिन्छ।
यो पहिले रिपोर्ट गरिएको छ कि स्पाइड्रोइन दोहोरिने र QDs, जो रेशम कताईको समयमा β-शीट स्विचनबाट गुज्रिएको देखिन्छ, हाइड्रोजेलहरू बनाउँछ।हाम्रो खोजहरूको तुलनामा, इन्क्युबेशन समय र/वा इन्क्युबेशन तापमान क्रमशः उल्लेखनीय रूपमा लामो वा उच्च थियो, र परिणामस्वरूप हाइड्रोजेलहरू प्रायः अपारदर्शी थिए (चित्र 7 र पूरक तालिका 1) 37, 38, 63, 64, 65, 66, 67, 68। , 69. छिटो जेल समयको अतिरिक्त, NT हाइड्रोजेल > 300 mg/mL (30%) ले अन्य सबै वर्णित रिकम्बिनेन्ट स्पाइडर सिल्क प्रोटीन हाइड्रोजेलहरू, साथै प्राकृतिक हाइड्रोजेलहरू जस्तै जिलेटिन, अल्जिनेट (2%), अगर (0.5%) लाई पछाडि पार्यो। ) र कोलाजेन।(0.6%) (चित्र 7 र पूरक तालिकाहरू 1 र 3) 37,39,66,67,68,69,70,71,72,73,74।
यस अध्ययनमा हाइड्रोजेलहरूको जेल समय र लोचदार मोडुलसलाई अन्य स्पाइड्रोइन-आधारित हाइड्रोजेलहरू र चयन गरिएका प्राकृतिक हाइड्रोजेलहरूसँग तुलना गरिएको थियो।सन्दर्भहरू जेलेशन अवस्थाहरूको विवरणको साथ दिइन्छ।APS अमोनियम पर्सल्फेट, कोठाको तापमान।डेटा ३७, ३८, ३९, ६४, ६५, ६६, ६७, ६८, ६९, ७०, ७१, ७२, ७३, ७४।
माकुराहरूले भण्डारणको समयमा स्पाइड्रोइनलाई जेलिङबाट रोक्ने तरिकाहरू विकास गरेको देखिन्छ।रेशम ग्रंथिमा प्रोटिनको उच्च एकाग्रताको बाबजुद, टर्मिनल डोमेनसँग सम्बन्धित ठूलो दोहोरिने क्षेत्रको अर्थ यो अध्ययनको सीमामा ग्रन्थीमा NT र CT को स्पष्ट एकाग्रता लगभग 10-20 mg/ml सँग मेल खान्छ।इन भिट्रो अवलोकन हाइड्रोजेल गठन को लागी आवश्यक छ।थप रूपमा, लवणको समान सांद्रता 16 स्थिर NT, रेशम ग्रंथिहरूमा जस्तै (चित्र 5b)।NT कन्फर्मेसन ई. कोलाई साइटोसोलमा अध्ययन गरिएको छ र भिट्रोमा जाँच गर्दा भन्दा बढी बलियो रूपमा फोल्ड गरिएको पाइन्छ, यसले थप संकेत गर्छ कि नुन वा अन्य कारकहरूले भिभोमा यसको एकत्रीकरणलाई रोक्छ।यद्यपि, NTs को β-शीट फाइब्रिल्समा रूपान्तरण गर्ने क्षमता फिलामेन्ट गठनको लागि महत्त्वपूर्ण हुन सक्छ र भविष्यका अध्ययनहरूमा अनुसन्धान गरिनु पर्छ।
यस अध्ययनमा अवलोकन गरिएको NT-amyloid-जस्तो फाइब्रिल र हाइड्रोजेल गठनको उपन्यास पक्षहरूको अतिरिक्त, हामी यो पनि देखाउँछौं कि यो घटनामा बायोटेक्नोलोजिकल र बायोमेडिकल अनुप्रयोगहरू हुन सक्छन् (चित्र 8)।अवधारणाको प्रमाणको रूपमा, हामीले NT लाई GFP वा PNP सँग जोड्यौं र देखायौं कि फ्युजन प्रोटीनले 37 ° C मा इन्क्युबेटेड हुँदा हाइड्रोजेलहरू पनि बनाउँछ र GFP र PNP अंशहरूले ठूलो मात्रामा गेलेसन पछि आफ्नो गतिविधि कायम राख्छन् (चित्र 6)।Nucleoside phosphorylases nucleoside analogues75 को महत्वपूर्ण उत्प्रेरक संश्लेषण हो, जसले हाम्रो खोजलाई बायोफार्मास्युटिकल उद्योगको लागि सान्दर्भिक बनाउँछ।अनुकूल परिस्थितिहरूमा पारदर्शी हाइड्रोजेलहरू बनाउने फ्यूजन प्रोटीनहरू अभिव्यक्त गर्ने अवधारणाले इन्जाइम इमोबिलाइजेसन, नियन्त्रित ड्रग रिलिज र टिस्यु इन्जिनियरिङ जस्ता अनुप्रयोगहरूको विस्तृत दायराको लागि अनुकूल गुणहरूको साथ कार्यात्मक हाइड्रोजेलहरू सिर्जना गर्न अनुमति दिन्छ।थप रूपमा, NT र NT* कुशल अभिव्यक्ति मार्करहरू 30 हुन्, जसको अर्थ NT र यसको भेरियन्टहरू घुलनशील फ्युजन प्रोटीनहरूको उच्च-थ्रुपुट उत्पादन र 3D हाइड्रोजेलहरूमा स्थिर लक्ष्य प्रोटीनहरूको पछिको सिर्जनाको लागि प्रयोग गर्न सकिन्छ।
NT घुलनशील, α-पेचदार र कम सांद्रता (µM) र 37°C मा स्थिर हुन्छ।उही तापक्रममा, तर बढ्दो सांद्रतामा (>10 mg/ml), NT ले एमाइलोइड-जस्तो फाइब्रिलहरू मिलेर जेल बनाउँछ।NT फ्युजन प्रोटीनहरूले पूर्ण कार्यात्मक फ्यूजन टुक्राहरूसँग फाइब्रिलर जेलहरू पनि बनाउँछ, जसले विभिन्न प्रोटीनहरूलाई NT प्रयोग गरेर 3D हाइड्रोजेलहरूमा स्थिर गर्न अनुमति दिन्छ।तल: NT (PDB: 4FBS) र फाइबर नेटवर्कहरू र सम्बन्धित प्रोटीन संरचनाहरूको दृष्टान्तहरू (मानिएको र मापनमा कोरिएको छैन, GFP PDB: 2B3Q, 10.2210/pdb2B3Q/pdb; PNP PDB: 4RJ2, 10.22210/pdbRdJ)।
निर्माणहरू (एमिनो एसिड अनुक्रमहरू सहित पूर्ण सूचीको लागि पूरक तालिका 4 हेर्नुहोस्) लाई प्लाज्मिड pT7 मा क्लोन गरियो र E. coli BL21 (DE3) मा रूपान्तरण गरियो।इन्जिनियर गरिएको प्लाज्मिड युक्त ई. कोलाई लुरिया ब्रोथमा कानामाइसिन (७० मिलीग्राम/लिटर) को साथमा इनोक्युलेट गरियो र ३० डिग्री सेल्सियस र २५० आरपीएममा रातभर हुर्कियो।त्यसपछि कल्चरलाई 1/100 एलबी माध्यममा कानामाइसिन समावेश गरी 30 डिग्री सेल्सियस र 110 आरपीएममा OD600 ०.८ नपुगुञ्जेल कल्चर गरिएको थियो।NMR अध्ययनहरूको लागि, ब्याक्टेरियाहरू M9 न्यूनतम माध्यममा 2 ग्राम D-ग्लुकोज 13C (Aldrich) र 1 ग्राम अमोनियम क्लोराइड 15N (क्याम्ब्रिज आइसोटोप प्रयोगशालाहरू, Inc.) आइसोटोपहरूसँग प्रोटीन लेबलिंगको लागि हुर्किएका थिए।तापमानलाई २० डिग्री सेल्सियससम्म घटाउनुहोस् र ०.१५ एमएम आइसोप्रोपाइलथियोगलाक्टोपाइरानोसाइड (अन्तिम एकाग्रता) सँग प्रोटीन अभिव्यक्ति उत्पन्न गर्नुहोस्।रातभर प्रोटीन अभिव्यक्ति पछि, कोशिकाहरू 7278×g, 20 मिनेटको लागि 4°C मा काटियो।सेल पेलेटहरू 20 एमएम Tris-HCl, pH 8 मा पुन: निलम्बन गरियो र अर्को प्रयोग नभएसम्म स्थिर गरियो।30 kPa मा सेल डिसप्टर (टीएस सिरिज मेसिन, कन्स्ट्यान्ट सिस्टम्स लिमिटेड, इङ्गल्याण्ड) को प्रयोग गरेर पग्लिएको कोशिकाहरू लाईज गरियो।त्यसपछि 4 डिग्री सेल्सियसमा 30 मिनेटको लागि 25,000 ग्राममा लाइसेटहरू सेन्ट्रीफ्यूज गरियो।NTMiSp को लागि, गोलीलाई 2 M यूरिया, 20 mM Tris-HCl, pH 8 मा पुन: निलम्बन गरिएको थियो, र 2 मिनेट (2 s अन/अफ, 65%) को लागि सोनिक गरिएको थियो, त्यसपछि फेरि 25,000 xg, 4° C भित्र सेन्ट्रीफ्यूज गरियो। ३० मिनेटसुपरनेटेन्टलाई Ni-NTA स्तम्भमा लोड गरिएको थियो, 20 mM Tris-HCl, 2 mM imidazole, pH 8 ले धोइयो, र अन्तमा प्रोटिनलाई 20 mM Tris-HCl, 200 mM इमिडाजोल, pH 8 ले पखालियो। NT2RepCT र उत्पन्न गर्न NTCT, थ्रोम्बिन पाचनले उनको र NT बीचको साइट (ThrCleav) लाई परिचय गराउँछ।थ्रोम्बिन क्लीभेज साइटहरू His-NT-ThrCleav-2Rep (2Rep उत्पादन गर्दछ), His-thioredoxin-ThrCleav-NT (NT उत्पादन गर्दछ), His-thioredoxin-ThrCleav-CT (CT उत्पादन गर्दछ), His-Thioredoxin-ThrCleav-NT मा पनि उपस्थित छन्। ।* (NT* उत्पादन गर्दछ), His-Thioredoxin-ThrCleav-NTA72R (NTA72R उत्पादन गर्दछ), His-Thioredoxin-ThrCleav-NTFlSp (NTF1Sp उत्पादन गर्दछ), र His-Sulphur Redoxin-ThrCleav-NTMiSp (N उत्पादन गर्दछ)।निर्माणहरू थ्रोम्बिन (1:1000) द्वारा पचाइएको थियो र 6-8 kDa को आणविक तौल थ्रेसहोल्डको साथ स्पेक्ट्रा/पोर डायलिसिस झिल्ली प्रयोग गरेर 20 मिमी Tris-HCl, pH 8 को साथ 4° C मा रातभर डायलाइज गरियो।डायलासिस पछि, घोललाई Ni-NTA स्तम्भमा लोड गरिन्छ र रूचिको प्रोटिन भएको फोहोर सङ्कलन गरिन्छ।प्रोटिन सांद्रता NTF1Sp बाहेक, प्रत्येक प्रोटिनको विलुप्त गुणांक प्रयोग गरेर 280 nm मा UV अवशोषण मापन गरेर निर्धारित गरिएको थियो, जसले निर्माताको प्रोटोकल अनुसार ब्राडफोर्ड परख प्रयोग गर्‍यो।शुद्धता SDS polyacrylamide (4–20%) जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस र Coomassie briliant blue staining द्वारा निर्धारण गरिएको थियो।प्रोटिनहरू सेन्ट्रीफ्यूज फिल्टरहरू (VivaSpin 20, GE Healthcare) 4000 xg मा 10 kDa आणविक वजन कटअफको साथ 20 मिनेट चक्रमा केन्द्रित गरियो।
प्रोटिन घोललाई पगाल्नुहोस् र 150 μl लाई 1 मिलीलीटर स्पष्ट सेप्टम शीशी (8 x 40 मिमी थर्मो साइन्टिफिक) मा ध्यानपूर्वक पिपेट गर्नुहोस्।वाष्पीकरण रोक्नको लागि ट्युबहरूलाई क्याप गरी प्याराफिल्मले बन्द गरिएको थियो।नमूनाहरू (n = 3) 37°C वा 60°C मा इन्क्युबेटेड थिए र आवधिक रूपमा gelation अवलोकन गर्न उल्टो गरियो।जेल नगर्ने नमूनाहरू कम्तिमा एक हप्ताको लागि इन्क्युबेटेड गरियो।NTMiSp डाइसल्फाइड बन्डहरू 10 mM DTT प्रति 10 µM प्रोटीनसँग घटाउनुहोस्।प्राकृतिक स्पाइडर रेशम कोटिंग्सको गेलेसनको विश्लेषण गर्न, स्वीडिश ब्रिज स्पाइडर काटियो, दुई मुख्य एम्पुलेटेड ग्रन्थिहरू 20 एमएम Tris-HCl बफर pH 8 को 200 μl मा राखियो र कोटिंगलाई ग्रन्थिहरूबाट अलग गर्न अनुमति दिन काटियो।।ग्रन्थीहरूको सामग्रीहरू बफरमा भंग गरिन्छ, सुख्खा तौल निर्धारणको लागि 50 μl (निरन्तर वजनमा 60 डिग्री सेल्सियसमा खुला शीशीहरू इन्क्युबेशन गरेर) र 37 डिग्री सेल्सियसमा गेलेसनको लागि 150 μl।
मापन ज्यामिति/उपकरण २० मिमीको शीर्ष व्यास र ०.५ मिमीको अन्तर भएको समानान्तर प्लेट प्रयोग गरेर स्टेनलेस स्टीलबाट बनेको हुन्छ।नमूनालाई 25°C देखि 45°C सम्म र 25°C मा 1°C प्रति मिनेटको दरले स्टेनलेस स्टीलको तल्लो पेल्टियर प्लेट प्रयोग गरी तताउनुहोस्।कम्पन मापनहरू 0.1 Hz को फ्रिक्वेन्सीमा र सामग्रीको रेखीय भिस्कोइलास्टिक क्षेत्रमा 5% र 0.5% को स्ट्रेनमा 100 mg/mL र 300-500 mg/mL को नमूनाहरूको लागि क्रमशः गरिएको थियो।वाष्पीकरण रोक्न अनुकूलन आर्द्रता कक्ष प्रयोग गर्नुहोस्।प्रिज्म ९ प्रयोग गरेर डाटा विश्लेषण गरिएको थियो।
कोठाको तापक्रममा ८०० देखि ३९०० सेमी–१ सम्म इन्फ्रारेड (IR) स्पेक्ट्रा सङ्कलन गर्न।एटीआर उपकरण, साथै स्पेक्ट्रोमिटर मार्फत प्रकाश मार्ग, प्रयोग अघि र समयमा सुख्खा फिल्टर गरिएको हावाको साथ शुद्ध गरिन्छ।समाधानहरू (500 mg/mL स्पेक्ट्रामा पानी अवशोषण चुचुराहरू कम गर्न) क्रिस्टलहरूमा पाइप गरिएको थियो, र gels (500 mg/mL) मापन अघि गठन गरियो र त्यसपछि क्रिस्टलहरूमा हस्तान्तरण गरियो (n = 3)।1000 स्क्यानहरू 2 cm-1 को रिजोल्युसन र 2 को शून्य शुल्क चक्र संग रेकर्ड गरियो। दोस्रो व्युत्पन्न OPUS (Bruker) को प्रयोग गरी नौ अंकको स्मूथिङ दायरा प्रयोग गरी गणना गरिएको थियो।F. Menges "Spectragryph - Optical Spectroscopy Software" को प्रयोग गरेर 1720 र 1580 cm-1 को बीचमा समान एकीकरण क्षेत्रमा स्पेक्ट्रालाई सामान्यीकृत गरिएको थियो।एटीआर-आईआर स्पेक्ट्रोस्कोपीमा, नमूनामा इन्फ्रारेड बीमको प्रवेश गहिराइ वेभनम्बरमा निर्भर हुन्छ, जसले उच्च तरंग नम्बरहरूको तुलनामा कम तरंग संख्याहरूमा बलियो अवशोषण गर्दछ।यी प्रभावहरू फिग्समा देखाइएको स्पेक्ट्राको लागि सुधार गरिएको छैन।3 किनभने तिनीहरू धेरै सानो छन् (पूरक चित्र। 4)।यस आंकडाको लागि सही स्पेक्ट्रा Bruker OPUS सफ्टवेयर प्रयोग गरेर गणना गरिएको थियो।
सिद्धान्तमा, एमाइड I चोटी भित्र कम्पोनेन्टहरूको भरपर्दो डिकन्भोल्युसन पछि प्रोटीन कन्फर्मेसनको व्यापक परिमाणीकरण सम्भव छ।तर, व्यवहारमा केही बाधाहरु आइरहन्छन् ।स्पेक्ट्रम मा शोर deconvolution को समयमा (झूटा) शिखर को रूप मा देखा पर्न सक्छ।थप रूपमा, पानीको झुकावको कारण शिखर एमाइड I शिखरको स्थितिसँग मेल खान्छ र ठूलो मात्रामा पानी भएको नमूनाहरूको लागि समान परिमाण हुन सक्छ, जस्तै यहाँ अध्ययन गरिएको जलीय जेल।तसर्थ, हामीले एमाइड I चोटीलाई पूर्ण रूपमा विघटन गर्ने प्रयास गरेका छैनौं, र हाम्रो अवलोकनहरू NMR स्पेक्ट्रोस्कोपी जस्ता अन्य विधिहरूको समर्थनमा मात्र विचार गर्नुपर्छ।
50 mg/ml NT र His-NT2RepCT को समाधानहरू 37 डिग्री सेल्सियसमा रातभर जेलिएको थियो।त्यसपछि हाइड्रोजेललाई 20 एमएम ट्रिस-एचसीएल (पीएच 8) संग 12.5 मिलीग्राम / एमएलको एकाग्रतामा पातलो गरियो, राम्रोसँग हल्लाइयो र जेल तोड्न पाइपेट गरियो।त्यसपछि, हाइड्रोजेललाई 20 एमएम Tris-HCl (pH 8) सँग 10 पटक पातलो गरियो, नमूनाको 5 μl तामाको ग्रिडमा formvar लेपित गरियो, र थप नमूना ब्लटिंग पेपरको साथ हटाइयो।नमूनाहरू 5 μl MilliQ पानीले दुई पटक धोइयो र 5 मिनेटको लागि 1% uranyl ढाँचामा दाग गरियो।अवशोषक कागजको साथ अतिरिक्त दाग हटाउनुहोस्, त्यसपछि जाललाई हावा सुकाउनुहोस्।यी ग्रिडहरूमा 100 kV मा सञ्चालन हुने FEI Tecnai 12 Spirit BioTWIN प्रयोग गरेर इमेजिङ गरिएको थियो।तस्बिरहरू x 26,500 र x 43,000 म्याग्निफिकेसनहरूमा Veleta 2k × 2k CCD क्यामेरा (Olympus Soft Imaging Solutions, GmbH, Münster, Germany) प्रयोग गरेर रेकर्ड गरिएको थियो।प्रत्येक नमूनाको लागि (n = 1), 10-15 छविहरू रेकर्ड गरियो।ImageJ (https://imagej.nih.gov/) छवि विश्लेषण र फाइबर व्यास (n = 100, विभिन्न फाइबर) को मापनको लागि प्रयोग गरिएको थियो।प्रिज्म 9 को प्रयोग नगरिएको टी-टेस्ट (दुई पुच्छर) गर्न प्रयोग गरिएको थियो।औसत His-NT2RepCT र NT fibrils क्रमशः 11.43 (SD 2.035) र 7.67 (SD 1.389) nm थिए।आत्मविश्वास अन्तराल (95%) -4.246 देखि -3.275 हो।स्वतन्त्रताको डिग्री = 198, p <0.0001।
10 µM thioflavin T (ThT) युक्त तरल नमूनाहरूको 80 μl कोर्निङ 96-वेल कालो तल स्पष्ट तल प्लेटहरू (कोर्निङ ग्लास 3881, संयुक्त राज्य अमेरिका) को प्रयोग गरेर स्थिर अवस्थाहरूमा ट्रिपलिकेट (n = 3) मा मापन गरियो।फ्लोरोसेन्स भिन्नताहरू 440 nm उत्तेजना फिल्टर र 480 nm उत्सर्जन फिल्टर (BMG Labtech, Offenburg, Germany बाट FLUOStar Galaxy) प्रयोग गरी रेकर्ड गरिएको थियो।ThT संकेत न त संतृप्त थियो न त शमन गरिएको थियो, किनकि ThT को विभिन्न सांद्रताका साथ प्रयोगहरू सिग्नल तीव्रता परिवर्तन नगरी प्रदर्शन गरिएको थियो।धुवाँ मापनको लागि 360 nm मा रेकर्ड अवशोषण।बीउ प्रयोगका लागि, 100 mg/mL जेलहरू 37° C. मा बनाइयो, पुन: निलम्बन गरियो, र 5%, 10%, र 20% को दाढ़ अनुपातमा बीउको लागि प्रयोग गरियो।प्रिज्म ९ प्रयोग गरेर डाटा विश्लेषण गरिएको थियो।
His-NT2RepCT र NT>100 mg/mL को स्टकहरू बरफमा पगाल्नुहोस् र 0.22 µm फिल्टर मार्फत फिल्टर गर्नुहोस्।Nanodrop प्रयोग गरेर 280 nm मा अवशोषण मापन गरेर सांद्रता गणना गरिएको थियो।स्पष्ट तलको साथ 96-वेल कालो गैर-बाइन्डिङ प्लेट (कोर्निङ) को इनारहरूमा, नमूनाहरू 20 mM Tris-HCl pH 8 मा 20 mg/ml मा पातलो गरियो र 5 μM ThT (अन्तिम एकाग्रता), कुल नमूना एकाग्रतामा मिसाइयो। 50 μl भोल्युम।नमूनाहरू प्रत्येक 10 मिनेटमा 37 ° C मा सेलअब्सर्भर (Zeiss) माइक्रोस्कोपमा ट्रान्समिटेड लाइट च्यानल र FITC उत्तेजना र ThT इमेजिङका लागि उत्सर्जन फिल्टर सेटहरूको साथ इमेज गरिएको थियो।इमेजिङका लागि २०x/०.४ लेन्स प्रयोग गरिन्छ।Zen Blue (Zeiss) र ImageJ (https://imagej.nih.gov/) छवि विश्लेषणको लागि प्रयोग गरियो।NT र His-NT2RepCT समाधानहरूबाट 50 mg/mL को एकाग्रतामा 20 mM Tris pH 8 र 5 µM ThT समावेश गरी 90 मिनेटको लागि 37 डिग्री सेल्सियसमा इन्क्युबेटेड जेलहरू पनि तयार गरियो।जेलका टुक्राहरूलाई 20 mM Tris, pH 8, र 5 μM ThT समावेश गरिएको एउटा गैर-बाध्यकारी कालो 96 राम्रोसँग स्पष्ट तल्लो प्लेटमा सारिएको थियो।20x/0.4 म्याग्निफिकेसनमा हरियो प्रतिदीप्ति र उज्यालो क्षेत्र छविहरू प्राप्त गर्नुहोस्।ImageJ छवि विश्लेषणको लागि प्रयोग गरिएको थियो।
समाधान NMR स्पेक्ट्रा 310 K मा 600 MHz Bruker Avance Neo स्पेक्ट्रोमिटरमा QCI Quadrupole Resonance Pulsed Gradient Field Cryoprobe (HFCN) ले प्राप्त गरियो।13C, 15N ले लेबल गरिएको 10 mg/mL समरूप प्रोटीन युक्त NMR नमूनाहरू, 20 mM Tris-HCl (pH 8), 0.02% (w/v) NaN3, 5% DO (v/v), (n = 1) मा विघटित ।NT2RepCT को pH 6.7 मा रासायनिक परिवर्तनहरू 15N-HSQC को 2D स्पेक्ट्रममा शिखर 23 तोक्न प्रयोग गरियो।
13C को जादुई कोण स्पिनिङ ठोस NMR (MAS) स्पेक्ट्रा, 15N-लेबल गरिएको हाइड्रोजेलहरू 800 MHz मा 3.2 mm 13C/15N{1H} इलेक्ट्रोनलेस प्रोबसँग सुसज्जित ब्रुकर Avance III HD स्पेक्ट्रोमिटरमा रेकर्ड गरियो।नमूना तापमान 277 KHz मा एक चर तापमान ग्यास प्रवाह प्रयोग गरेर नियन्त्रण गरिएको थियो। दुई-आयामी द्विध्रुव रोटेशनल अनुनाद (DARR) 76 र रेडियो फ्रिक्वेन्सी पुन: जडान (RFDR) 77 स्पेक्ट्रा क्रमशः 12.5 kHz र 20 kHz को MAS फ्रिक्वेन्सीहरूमा प्राप्त गरियो।1H देखि 13C सम्म क्रस ध्रुवीकरण (CP) लाई 1H मा 60.0 देखि 48.0 kHz सम्म, 13C मा 61.3/71.6 kHz (12.5/20 kHz MAS मा) र सम्पर्क समय 0.5-1 ms मा रैखिक र्याम्प प्रयोग गरी प्रदर्शन गरिएको थियो।73.5 kHz मा स्पाइनल6478 decoupling डाटा संग्रह को समयमा प्रयोग गरिएको थियो।अधिग्रहण समय 10 मिलिसेकेन्ड थियो र चक्र ढिलाइ 2.5 सेकेन्ड थियो।RFDR स्पेक्ट्रामा अवलोकन गरिएको एकल-लिंक गरिएको Cα/Cβ सहसंबंधहरू DARR स्पेक्ट्रामा विशेषता अवशेष-प्रकार रासायनिक शिफ्टहरू र गुणा-लिङ्क गरिएको सहसंबंधको आधारमा तोकिएको थियो।
Zipper79 डाटाबेस (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/) NT, NTFlSp, र NTMiSp को लागि फ्लटर प्रवृत्ति र Rosetta ऊर्जा मूल्याङ्कन गर्न प्रयोग गरिएको थियो।जिपर डाटाबेसले Rosetta Energy80 को कम्प्युट गर्छ, जसले प्रोटीन संरचनाको मोडेल र विश्लेषण गर्न धेरै नि:शुल्क ऊर्जा कार्यहरू संयोजन गर्दछ।-23 kcal/mol वा कमको ऊर्जा स्तरले फाइब्रिलेटको उच्च प्रवृत्तिलाई संकेत गर्दछ।कम ऊर्जाको अर्थ जिपर कन्फर्मेसनमा दुई β-स्ट्र्यान्डहरूको अधिक स्थिरता हो।थप रूपमा, वाल्ट्ज एल्गोरिथ्म NT, NTFlSp र NTMiSp Ref मा amyloidogenic क्षेत्रहरूको भविष्यवाणी गर्न प्रयोग गरिएको थियो।८१। (https://waltz.switchlab.org/)।
NT प्रोटीन समाधान 2-(N-morpholino) ethanesulfonic एसिड (MES) बफर संग पीएच 5.5 र 6.0 मा क्रमशः pH 6 र 7 मा कम गर्न को लागी मिश्रित थियो।अन्तिम प्रोटीन एकाग्रता 100 मिलीग्राम / एमएल थियो।
मापन J-1500 CD स्पेक्ट्रोमिटर (JASCO, USA) मा 0.1 cm को अप्टिकल मार्गको साथ 300 μL क्युवेट प्रयोग गरेर प्रदर्शन गरिएको थियो।प्रोटिनहरू 10 μM (n = 1) मा 20 mM फस्फेट बफर (pH 8) मा पातलो गरियो।नुनको उपस्थितिमा प्रोटीन स्थिरताको विश्लेषण गर्न, प्रोटिनहरू क्रमशः 154 mM NaF वा NaCl भएको 20 mM फस्फेट बफर (pH 8) मा समान एकाग्रता (n = 1) मा विश्लेषण गरियो।तापमान स्क्यानहरू 222 nm मा 25°C देखि 95°C सम्म 1°C/min को ताप दरको साथ रेकर्ड गरियो।नेटिभ फोल्ड प्रोटीनहरूको अनुपात सूत्र (KDmeasure – KDfinal)/(KDstart – KDfinal) प्रयोग गरेर गणना गरिएको थियो।थप रूपमा, प्रत्येक नमूनाको लागि 260 nm देखि 190 nm सम्म 25 ° C मा र 95 ° C मा तताए पछि पाँच स्पेक्ट्रा रेकर्ड गरिएको थियो।पाँच स्पेक्ट्रा औसत, चिकनी र मोलर अण्डाकारमा रूपान्तरण गरियो।प्रिज्म ९ प्रयोग गरेर डाटा विश्लेषण गरिएको थियो।
His-NT-GFP (300 mg/mL, 80 µL) को प्रतिदीप्तता तीव्रता स्थिर अवस्थाहरूमा कालो पारदर्शी तल (Corning Glass 3881, USA) सँग 96-वेल कर्निङ प्लेटहरूमा ट्रिपलिकेट (n = 3) मा मापन गरिएको थियो।395 nm को उत्तेजना तरंग लम्बाइको साथ फ्लोरोसेन्स-आधारित प्लेट रिडरको साथ नमूनाहरू मापन गर्नुहोस् र उत्सर्जनलाई 509 nm मा गेलेसन अघि र 2 घण्टा पछि 37 डिग्री सेल्सियसमा रेकर्ड गर्नुहोस्।डेटा प्रिज्म 9 को साथ विश्लेषण गरिएको थियो।
Purine nucleoside phosphorylase गतिविधि परख किट (fluorometric विधि, Sigma Aldrich) निर्माताको निर्देशन अनुसार प्रयोग गरिएको थियो।His-NT-PNP भएको जेल र समाधानहरूमा गतिविधि मापन गर्न, His-NT-PNP को 10 ng 100 mg/mL NT सँग 2 μL को कुल भोल्युममा मिलाउनुहोस् किनभने जेलले सेटको पत्ता लगाउने अन्तरालभन्दा माथि संकेत दिएको थियो।His-NT-PNP बिना जेल र समाधानहरूको लागि नियन्त्रणहरू समावेश गरिएको थियो।मापन दुई पटक (n = 2) गरियो।गतिविधि मापन गरिसकेपछि, प्रतिक्रिया मिश्रण हटाइयो र जेल मापनको समयमा जेल अक्षुण्ण रह्यो भनेर सुनिश्चित गर्न फोटो खिचियो।प्रिज्म ९ प्रयोग गरेर डाटा विश्लेषण गरिएको थियो।
अध्ययन डिजाइनको बारेमा थप जानकारीको लागि, यस लेखमा लिङ्क गरिएको प्रकृति अध्ययन सार हेर्नुहोस्।
आंकडा १ र २ ले प्रारम्भिक डाटा प्रस्तुत गर्दछ।1c, 2a-c, 3a, b, e-g, 4, 5b, d, f, र 6, पूरक फिगहरू।3, पूरक अंजीर।5a, d, पूरक फिग।6 र पूरक अंजीर।8. यस अध्ययनको डेटा डेटा Zenodo डेटाबेस https://doi.org/10.5281/zenodo.6683653 मा होस्ट गरिएको छ।यस अध्ययनमा प्राप्त NMR डाटा प्रविष्टि ID bmrbig36 अन्तर्गत BMRBig भण्डारमा पोस्ट गरिएको थियो।GFP र PNP को संरचना PDB (GFP 2B3Q, PNP 4RJ2) बाट लिइएको थियो।
राइजिङ, ए र जोहानसन, जे स्पिनिङ आर्टिफिशियल स्पाइडर रेशम।राष्ट्रिय रसायन।जीवविज्ञान।११, ३०९–३१५ (२०१५)।
Babb, PL et al।नेफिला क्लेभिप्स जीनोमले स्पाइडर रेशम जीनको विविधता र तिनीहरूको जटिल अभिव्यक्तिलाई हाइलाइट गर्दछ।राष्ट्रिय जेनेट।४९, ८९५–९०३ (२०१७)।