ASTM A790 2507 / 2205 1.4462 / 1.4410 रासायनिक उद्योग रासायनिक कम्पोनेन्टको लागि डुप्लेक्स वेल्डेड ट्यूब, SPECC1L को कमीले विभाजित जोडहरूको स्थिरता बढाउँछ र क्रेनियल न्यूरल क्रेस्ट सेलहरूको कम सेडिङ निम्त्याउँछ।

Nature.com भ्रमण गर्नुभएकोमा धन्यवाद।तपाईं सीमित CSS समर्थनको साथ ब्राउजर संस्करण प्रयोग गर्दै हुनुहुन्छ।उत्तम अनुभवको लागि, हामी तपाईंलाई अपडेट गरिएको ब्राउजर प्रयोग गर्न सिफारिस गर्छौं (वा इन्टरनेट एक्सप्लोररमा अनुकूलता मोड असक्षम गर्नुहोस्)।थप रूपमा, निरन्तर समर्थन सुनिश्चित गर्न, हामी शैलीहरू र जाभास्क्रिप्ट बिना साइट देखाउँछौं।

ASTM A790 2507 / 2205 1.4462 / 1.4410 रासायनिक उद्योगको लागि डुप्लेक्स वेल्डेड ट्यूब

Liaocheng Sihe एसएस सामग्री कं, लिमिटेड।एक अग्रणी निर्माता हो जो स्टेनलेस स्टील सिमलेस पाइपहरू, उज्यालो एनेलेड ट्यूबहरू, सिमलेस कोइल्ड ट्युबिङ आदिमा विशेषज्ञता प्राप्त गर्दछ।ग्राहकहरूको सुविधाको लागि, हामीले पाइप र ट्युबहरू पनि वेल्डेड गरेका छौं।Liaocheng Sihe एसएस सामग्री कं, लिमिटेड।सबैभन्दा उन्नत उत्पादन र परीक्षण उपकरणहरू छन्।हामी तपाईंको आवश्यकता पूर्ण रूपमा पूरा गर्न सक्छौं।मापदण्ड अनुसार धेरै कडाईका साथ, हामी द्वारा उत्पादित ट्यूबहरूमा सधैं सही OD र WT सहिष्णुता हुन्छ।सहिष्णुता नियन्त्रण कडाई मापदण्ड उत्पादन गर्न अनुसार छ।हाम्रा उत्पादनहरू सधैं ग्राहकहरूसँग सन्तुष्ट छन्।ग्राहकहरूले हाम्रा उत्पादनहरू खरिद गरेर थप नाफा कमाए।
a) OD (बाहिरी व्यास): 3.18mm देखि 101.6mm सम्म
b) WT (वाल मोटाई): 0.5mm देखि 20mm
ग) लम्बाइ: ग्राहकको आवश्यकता अनुसार
d) मानकहरू: ASTM A312;ASTM A269;ASTM A789;ASTM A790 आदि
ई) प्रक्रिया विधि: ERW, EFW आदि

स्लाइडरहरू प्रति स्लाइड तीन लेखहरू देखाउँदै।स्लाइडहरू मार्फत सार्नको लागि पछाडि र अर्को बटनहरू प्रयोग गर्नुहोस्, वा प्रत्येक स्लाइडमा सार्नको लागि अन्तमा स्लाइड नियन्त्रक बटनहरू प्रयोग गर्नुहोस्।
क्रेनियल न्यूरल क्रेस्ट कोशिकाहरू (CNCC) भ्रूणको तंत्रिका तहहरू बन्द गर्छ र फरिन्जियल आर्चहरूमा बसाइँ सर्छ, जसले धेरै जसो मिडफेस संरचनाहरू बनाउँछ।CNCC डिसफंक्शनले ओरोफेसियल क्लेफ्टको एटियोलोजीमा महत्त्वपूर्ण भूमिका खेल्छ, एक सामान्य जन्मजात विकृति।हेटरोजाइगस SPECC1L उत्परिवर्तन atypical र syndromic clefts भएका बिरामीहरूमा फेला परेको छ।यहाँ, हामी क्यानोनिकल एडहेसिभ जंक्शन (AJ) कम्पोनेन्टहरू, β-catenin र E-cadherin को कल्चर्ड SPECC1L नकडाउन सेलहरूमा परिष्कृत दागको रिपोर्ट गर्छौं, र इलेक्ट्रोन माइक्रोग्राफहरूले AJ को एपिकल-बेसल प्रसार देखाउँछन्।क्र्यानोफेसियल मोर्फोजेनेसिसमा SPECC1L को भूमिका बुझ्नको लागि, हामीले Specc1l कमजोर माउस मोडेल सिर्जना गर्यौं।Homozygous mutants भ्रूण घातक हुन्छन् र न्यूरल ट्युब बन्द हुने र CNCC ल्यामिनेशन बिग्रिएको देखाउँछन्।एजे प्रोटीन दाग उत्परिवर्ती तंत्रिका तहहरूमा बढेको छ।यो AJ दोष CNCC delamination मा एक दोष संग संगत छ, AJ विघटन आवश्यक छ।थप रूपमा, Specc11 उत्परिवर्तीहरूले PI3K-AKT संकेत कम गरेको छ र apoptosis बढेको छ।भिट्रोमा, जंगली-प्रकार कक्षहरूमा PI3K-AKT संकेतको हल्का अवरोध AJ परिवर्तनहरू प्रेरित गर्न पर्याप्त थियो।महत्त्वपूर्ण रूपमा, SPECC1L नकडाउन द्वारा प्रेरित AJ परिवर्तनहरू PI3K-AKT मार्ग सक्रिय गरेर उल्टाउन सकिन्छ।सँगै लिइएको, यी डेटाले सुझाव दिन्छ कि SPECC1L, PI3K-AKT संकेत र AJ जीवविज्ञानको उपन्यास नियामकको रूपमा, न्यूरल ट्यूब बन्द र CNCC स्तरीकरणको लागि आवश्यक छ।
क्रेनियल न्यूरल क्रेस्ट कोशिकाहरू (CNCCs) पृष्ठीय न्यूरोएक्टोडर्ममा स्थानीयकरण गर्दछ र एपिथेलियल-मेसेन्काइमल ट्रान्जिसन (EMT) 1,2,3 सम्मिलित प्रक्रिया मार्फत विकासशील न्यूरल फोल्डहरूको न्यूरोएपिथेलियमबाट अलग हुन्छ।प्रिमिग्रेटिंग एपिथेलियल सीएनसीसीहरूले इन्टरसेलुलर जंक्शनहरू बाधा पुर्‍याउँछन् र माइग्रेट गर्ने मेसेन्काइमल सीएनसीसी बन्छन् जसले पहिलो र दोस्रो फरिन्जियल आर्चहरू भर्छन् र अधिकांश क्र्यानोफेसियल कार्टिलेज बनाउँछन्।यसैले, CNCC प्रकार्यलाई नियमन गर्ने जीनहरू प्रायः क्रेनियोफेसियल जन्मजात विसंगतिहरू जस्तै ओरोफेसियल क्लेफ्ट्सको एटियोलोजीमा बाधित हुन्छन्, जसले सामान्यतया अमेरिकामा मात्र 1/800 जन्महरूलाई असर गर्छ।जन्मजात विकृति मध्ये एक 8.
CNCC को डिलेमिनेशन मुसामा भ्रूण विकासको 8.5 र 9.5 दिनको बीचमा पूर्ववर्ती न्यूरल ट्यूबको बन्दसँग मेल खान्छ।धेरै माउस ओरोफेसियल क्लेफ्ट-सम्बद्ध जीनका उत्परिवर्तीहरूले पनि Irf69,10, Ghrl310, Cfl111, र Pdgfrα12 सहित न्यूरल ट्यूब दोषको केही रूपहरू प्रदर्शन गर्छन्।यद्यपि, न्यूरल ट्यूब क्लोजर र CNCC स्तरीकरणको प्रक्रियाहरूलाई स्वतन्त्र मान्न सकिन्छ, किनकि Splotch mutant माउस (Pax3) ले CNCC स्तरीकरण वा माइग्रेसन 13,14 मा कुनै असर नगरी न्यूरल ट्यूब क्लोजरमा दोषहरू प्रदर्शन गर्दछ।CNCC विच्छेदन र न्यूरल ट्यूब क्लोजरमा दोषहरू भएका अतिरिक्त माउस मोडेलहरूले यी दुई प्रक्रियाहरूको साझा आणविक आधार चित्रण गर्न मद्दत गर्नेछ।
न्यूरोएपिथेलियल कोशिकाहरूबाट CNCC को अलगावका लागि चिपकने जंक्शनहरू (AJs) को विघटन आवश्यक छ, जुन प्रोटीन कम्प्लेक्सहरू समावेश गर्दछ, अन्यहरू बीच, E-cadherin, β-catenin, α-E-catenin, र α-actinin actin filaments 2 सँग सम्बन्धित। न्यूरल फोल्डहरूमा E-cadherin को ओभरएक्सप्रेसन अध्ययनले CNCC delamination मा कमी वा ढिलाइ देखायो।यसको विपरीत, E-cadherin को दमनले प्रारम्भिक स्तरीकरण 15,16 मा परिणाम दिन्छ।CNCC स्तरीकरणको क्रममा EMT लाई मध्यस्थता गर्ने धेरै कारकहरू ट्रान्सक्रिप्शन कारकहरू (AP2α, Id2, FOXD3, SNAIL, TWIST, SOX10) र एक्स्ट्रासेलुलर म्याट्रिक्स (ECM) रिमोडेलिंग प्रोटीनहरू जस्तै म्याट्रिक्स मेटालोप्रोटीनेसेस (MMPs) हुन्, यद्यपि CNCC हरू प्रत्यक्ष cytoskeleators हुन्। अझै थाहा छैन।PI3K-AKT मार्ग मुख्यतया क्यान्सर अनुसन्धानबाट, E-cadherin स्तरहरू विरोधी गर्न जानिन्छ।हालैका अध्ययनहरूले देखाएको छ कि मुसाहरूमा PDGFα-आधारित PI3K-AKT सिग्नलिङको हानिले क्रेनियोफेसियल असामान्यताहरू निम्त्याउँछ, जसमा क्लेफ्ट प्यालेट र न्यूरल ट्यूब दोषहरू छन्।यद्यपि, PI3K-AKT मार्ग र CNCC स्तरीकरणमा AJ स्थिरता बीचको सम्बन्ध स्पष्ट छैन।
हामीले पहिले नै SPECC1L लाई मुखबाट आँखासम्म फैलिएको गम्भीर क्लेफ्ट भएका दुई व्यक्तिमा पहिलो उत्परिवर्ती जीनको रूपमा पहिचान गरेका थियौं, जसलाई ओब्लिक क्लेफ्ट (ObFC) वा Tessier IV18 cleft भनिन्छ।SPECC1L उत्परिवर्तनहरू दुई बहु-जेनेरेसनल परिवारहरूमा अटोसोमल डोमिनेन्ट Opitz G/BBB सिन्ड्रोम (OMIM #145410) को पहिचान गरिएको छ, जसमा प्रभावित व्यक्तिहरूले हाइपरडिस्टेन्स र क्लेफ्ट लिप/प्यालेट19 प्रदर्शन गरेका थिए, र टिबी ओभरडिस्टेन्स सिन्ड्रोम भएको एउटा परिवारमा (OMIM #14545) ।Opitz G/BBB सिन्ड्रोमको आधा भन्दा बढी केसहरू X-linked (OMIM #300000) छन् र MID1 जीनमा उत्परिवर्तनको कारणले गर्दा हुन्छ, जसले माइक्रोट्यूब्युल-सम्बद्ध सेल कंकालको प्रोटीन 22 लाई एन्कोड गर्दछ।हामी परिकल्पना गर्छौं कि SPECC1L, माइक्रोट्यूब्युल र एक्टिन साइटोस्केलेटनसँग सम्बन्धित प्रोटिनले सेल आसंजन र माइग्रेसन 18 को समयमा एक्टिन साइटोस्केलेटन रिमोडेलिंगको लागि आवश्यक संकेत मध्यस्थता गर्न सक्छ।इन भिट्रो र भिभो अध्ययनहरू मार्फत, हामी अब SPECC1L लाई PI3K-AKT सिग्नलिङ मार्फत AJ स्थिरताको उपन्यास नियामकको रूपमा वर्णन गर्छौं।सेलुलर स्तरमा, SPECC1L कमीले प्यान-AKT प्रोटिनको स्तरमा कमी र AJ को apical-basal फैलावटमा वृद्धिको परिणामस्वरूप, जुन AKT मार्गको रासायनिक सक्रियताद्वारा हटाइयो।Vivo मा, Specc11-कम भ्रूणहरूले न्यूरल ट्यूब बन्द हुने र कम CNCC विच्छेदन देखाउँछन्।यसरी, अनुहार मोर्फोजेनेसिसको समयमा सामान्य CNCC प्रकार्यको लागि आवश्यक अत्यधिक विनियमित सेल आसंजन-आधारित सिग्नलिंगमा SPECC1L प्रकार्यहरू।
सेलुलर स्तरमा SPECC1L को भूमिकालाई चित्रण गर्न, हामीले SPECC1L18 मा पहिले वर्णन गरिएको स्थिर ओस्टियोसारकोमा सेल लाइन U2OS कमी प्रयोग गर्यौं।SPECC1L (kd) नकडाउनको साथ यी स्थिर U2OS कोशिकाहरूमा SPECC1L ट्रान्सक्रिप्ट र प्रोटीनको स्तरमा मध्यम (60-70%) कमी थियो, साथै एक्टिन साइटोस्केलेटन 18 को माइग्रेसन र पुनर्गठनमा त्रुटिहरू थिए। यसको विपरित, एक गम्भीर क्षणिक कमी। SPECC1L ले माइटोटिक दोष 23 निम्त्याउने देखाइएको छ।थप विशेषताहरूमा, हामीले हाम्रो स्थिर SPECC1L-kd कोशिकाहरूले धेरै उच्च स्तरको संगममा आकारविज्ञान परिवर्तन गरेको फेला पार्नुभयो (चित्र 1)।कम संगममा व्यक्तिगत नियन्त्रण कक्षहरू र kd कक्षहरू समान देखिन्थे (चित्र 1A, D)।फ्युजन पछि 24 घण्टा पछि, नियन्त्रण कक्षहरूले आफ्नो घनत्व आकार (चित्र 1B, E) कायम राख्छन्, जबकि SPECC1L-kd कोशिकाहरू लामो हुन्छन् (चित्र 1C, F)।सेल आकारमा यो परिवर्तनको हदलाई नियन्त्रण कक्षहरू र केडी कक्षहरूको भिवो लाइभ इमेजिङद्वारा कब्जा गरिएको थियो (चलचित्र १)।संगम कक्षहरूमा SPECC1L को भूमिका निर्धारण गर्न, हामीले पहिले यसको अभिव्यक्ति जाँच्यौं।हामीले फेला पार्‍यौं कि SPECC1L प्रोटिनको स्तर फ्यूजन (चित्र 1G) मा बढेको छ, जबकि SPECC1L ट्रान्सक्रिप्ट स्तर बढेको छैन (चित्र 1H)।थप रूपमा, कोशिकाको घनत्व बढ्दै जाँदा, SPECC1L प्रोटीन इन्टरसेलुलर सीमाहरू (चित्र 2A-E) मा जम्मा भयो, झिल्ली-सम्बन्धित β-catenin (Fig. 2A'-E') सँग ओभरल्याप गरिएको ढाँचाको साथ।SPECC1L को actin cytoskeleton 18,23 सँगको सम्बन्धलाई ध्यानमा राखेर हामीले SPECC1L ले एक्टिन-आधारित एडेसिभ जंक्शन (AJ) सँग अन्तर्क्रिया गर्छ भनेर परिकल्पना गर्यौं।
(AF) SPECC1L नकडाउन (DF) कक्षहरू नियन्त्रण U2OS कोशिकाहरू (AC) को तुलनामा उच्च संगम (F) मा लम्बिन्छन्।यहाँ देखाइएको छ टाइम बिन्दुहरू (T1, T3, T6) मध्ये तीन छन् जुन हामीले विभिन्न सेल घनत्वहरूको लागि चयन गरेका छौं।(G) पश्चिमी ब्लट विश्लेषणले देखाउँछ कि SPECC1L प्रोटीन उच्च डिग्री संगममा स्थिर हुन्छ नियन्त्रण कक्षहरूमा संगमको कम डिग्रीको तुलनामा।SPECC1L को पश्चिमी ब्लटले अपेक्षित 120 kDa ब्यान्ड र उच्च आणविक तौल ब्यान्ड देखाउँछ, सम्भवतः अनुवाद पछि परिमार्जन गरिएको (*)।पश्चिमी ब्लट विश्लेषण कम र उच्च संगम को लागि समान अवस्था अन्तर्गत प्रदर्शन गरिएको थियो।कम र उच्च संगममा SPECC1L देखाउने छविहरू एउटै ब्लटबाट लिइएका थिए।उही धब्बा हटाइयो र β-actin एन्टिबडी संग पुन: जाँच गरियो।(H) मात्रात्मक RT-PCR विश्लेषणले SPECC1L ट्रान्सक्रिप्ट स्तरहरूमा कुनै महत्त्वपूर्ण परिवर्तन देखाएको छैन।त्रुटि बारहरूले चार स्वतन्त्र प्रयोगहरूबाट SEM हरू प्रतिनिधित्व गर्दछ।
(AE) हामीले SPECC1L नकडाउन (kd) को साथ सेल आकार विश्लेषण र U2OS कक्षहरूमा AJ परिवर्तनहरू सामान्य बनाउन सेल घनत्वहरूको दायरा प्रतिनिधित्व गर्ने छ समय बिन्दुहरू (T1-T6) रोज्यौं।यी समय बिन्दुहरू मध्ये पहिलो पाँचमा एकल कक्षहरू (T1), सानो सेल क्लस्टरहरू (T2) को 50-70% फ्यूजन, kd कोशिकाहरू (T3) पुन: आकार नदिईकन फ्यूजन, kd कक्षहरू (T4) पुन: आकार दिने, र 24 घण्टा परिवर्तनहरू समावेश थिए।kd (T5) कोशिकाहरूको पछिल्लो रूपमा।SPECC1L प्रोटीन मुख्यतया T1 (A) मा साइटोप्लाज्ममा फैलिएको थियो, तर यसको संचय पछिको समय बिन्दुहरूमा इन्टरसेलुलर सीमाहरूमा अवलोकन गरिएको थियो (B-E, तीरहरू)।(FJ) β-catenin AJ जटिलसँग सम्बन्धित इन्टरसेलुलर सीमाहरूमा समान संचय देखाउँछ।(A'-E') SPECC1L र β-catenin ले उच्च सेल घनत्व (तीर) मा सेल बोर्डरहरूमा ओभरल्यापिङ स्टेनिङ देखाउँछ।(F'-J') SPECC1L-kd कोशिकाहरूमा, β-catenin दाग कम सेल घनत्व (F'-H') मा सामान्य देखिन्छ, तर सेल आकार परिवर्तन (I', J'; arrows) को रूपमा विस्तार हुन्छ, AJ को संकेत गर्दछ। परिवर्तन भएका छन् ।बार्स = 10 µm।
हामीले त्यसपछि AJ मा SPECC1L कमीको प्रभाव निर्धारण गर्ने प्रयास गर्यौं।हामीले धेरै AJ-सम्बन्धित मार्करहरू प्रयोग गर्यौं, जसमा क्यानोनिकल कम्पोनेन्टहरू F-actin, myosin IIb, β-catenin, र E-cadherin24,25,26,27।पहिले वर्णन गरिए अनुसार SPECC1L-kd कोशिकाहरूमा एक्टिन तनाव फाइबर बढ्यो (चित्र 3A,B) 18।एक्टिन फिलामेन्टसँग सम्बन्धित मायोसिन IIb ले भिट्रो (चित्र 3C,D) मा SPECC1L-kd कोशिकाहरूमा समान वृद्धि देखाएको छ।AJ-सम्बन्धित β-catenin कोशिका झिल्लीमा क्याडरिनसँग बाँध्छ, नियन्त्रण क्यूबोसाइट्स (चित्र 3E,G) मा सामान्य "हनीकोम्ब" अभिव्यक्ति ढाँचा देखाउँछ।चाखलाग्दो कुरा के छ भने, कन्फोकल माइक्रोस्कोपी प्रयोग गरी समतल तस्बिरहरूमा, β-catenin (Fig. 3E,F) र E-cadherin (Fig. 3G,H) संगमयुक्त SPECC1L-कम कोशिकाहरूको सेल झिल्लीमा दागले विस्तारित दागको प्रमुख ढाँचाहरू देखायो।केडी कोशिकाहरूमा AJ-सम्बन्धित β-catenin स्टेनिङ्को यो विस्तार संगममा सबैभन्दा स्पष्ट थियो, तर सेल आकारमा परिवर्तनहरू अघि देखा पर्यो (चित्र 2F-J, F'-J')।यस विस्तारित AJ दागको भौतिक प्रकृति निर्धारण गर्न, हामीले प्रसारण इलेक्ट्रोन माइक्रोस्कोपी (TEM) (चित्र 3I, J) द्वारा SPECC1L-kd U2OS कोशिकाहरूको एपिकल-बेसल सतहमा सेल सीमानाहरू जाँच गर्यौं।नियन्त्रण कक्षहरू (चित्र 3I) को विपरीत, जसमा AJ (तीरहरू) को सूचक छुट्टै इलेक्ट्रोन घने क्षेत्रहरू थिए, केडी कक्षहरू (चित्र 3J) ले एपिकोबासल प्लेनमा AJ को उच्च इलेक्ट्रोन घनत्व सूचकको ठूलो, सन्निहित क्षेत्रहरू देखाए।।थप रूपमा, ट्रान्सभर्स सेक्सनहरूमा, हामीले kd कोशिकाहरू (Fig. S1A,B) मा व्यापक सेल झिल्ली फोल्डहरू अवलोकन गर्यौं, जसले β-catenin र E-cadherin स्टेनिङ् ब्यान्डहरू (Fig. 3F, H) को विस्तारित ढाँचा बताउँछ।AJs मा SPECC1L को भूमिकाको समर्थनमा, β-catenin लाई SPECC1L सँग संगम U2OS कोशिकाहरू (चित्र 3K) को लाइसेट्समा सह-इम्युनोप्रेसिपिट गरिएको थियो।AJ मार्करहरूको लागि विस्तारित इम्युनोस्टेनिङको साथमा, TEM विश्लेषण हाम्रो परिकल्पनासँग अनुरूप थियो कि SPECC1L कमीले AJ एपिकल-बेसल घनत्व र भिन्नता बढाउँछ।
(AH) 48 घण्टा पोस्ट-फ्यूजन (T6; A, B) मा kd कोशिकाहरूमा बढेको F-actin दाग।F-actin (C, D) सँग सम्बन्धित मायोसिन IIb को बदलिएको दाग।नियन्त्रण कक्षहरू (E, G) मा β-catenin र E-cadherin झिल्ली दागको चिकनी ढाँचा SPECC1L-kd (F, H) कक्षहरूमा बढाइएको थियो।बार्स = 10 µm।(I-J) एपिकल-बेसल इन्टरसेलुलर जंक्शन अवलोकन गर्दै इलेक्ट्रोन माइक्रोग्राफ।नियन्त्रण कक्षहरूले टाँसिने जंक्शनहरू (I, तीरहरू) संकेत गर्ने फरक इलेक्ट्रोन-घन क्षेत्रहरू देखाउँछन्।यसको विपरित, SPECC1L-kd कोशिकाहरूमा सम्पूर्ण एपिकल-बेसल जंक्शन इलेक्ट्रोन घना (J, arrows) देखा पर्‍यो, जसले बढेको घनत्व र टाँसिने जंक्शनहरूको फैलावटलाई संकेत गर्दछ।(K) β-catenin सह-इम्युनोप्रेसिपिटेड SPECC1L सँग संगम U2OS सेल lysates मा थियो।चार स्वतन्त्र प्रयोगहरू मध्ये एक प्रतिनिधित्व गर्ने एउटा स्थानबाट लिइएको छवि।
क्र्यानोफेसियल मोर्फोजेनेसिसमा SPECC1L को भूमिका बुझ्नको लागि, हामीले दुईवटा स्वतन्त्र ES ट्र्याप सेल लाइनहरू, DTM096 र RRH048 (BayGenomics, CA) को प्रयोग गरेर एक Specc1l कमजोर माउस मोडेल सिर्जना गर्यौं, जसले intron 1 र Specc1l ट्रान्सक्रिप्टहरू F15 मा कैद गरिएको थियो। ।4A, चित्र S2)।डिकोय भेक्टर इन्सर्टको जीनोमिक स्थान सम्पूर्ण जीनोम अनुक्रम द्वारा निर्धारण गरिएको थियो र PCR (चित्र S2) द्वारा पुष्टि गरिएको थियो।दुबै जीन ट्र्याप डिजाइनहरूले पनि क्याप्चर गरेपछि Specc11-lacZ रिपोर्टरहरूको इन-फ्रेम फ्यूजनलाई अनुमति दियो।तसर्थ, X-gal staining द्वारा निर्धारित lacZ अभिव्यक्ति Specc11 अभिव्यक्तिको सूचकको रूपमा प्रयोग गरिएको थियो।दुबै एलिलहरूले समान lacZ अभिव्यक्ति ढाँचाहरू देखाए, INTRON 1 मा DTM096 जीन ट्र्यापले INTRON 15 मा RRH048 भन्दा बलियो अभिव्यक्ति देखाउँदछ (देखाइएको छैन)।यद्यपि, Specc1l E8.5 (चित्र 4B), न्यूरल ट्यूब र E9.5 र E10.5 (चित्र 4C, D) मा अनुहार प्रक्रियाहरूमा, र विकासशील अंगहरूमा न्यूरल फोल्डहरूमा विशेष गरी बलियो अभिव्यक्तिको साथ, व्यापक रूपमा व्यक्त गरिएको छ। E10 मा।5 र आँखा (चित्र 4D)।हामीले पहिले रिपोर्ट गरेका थियौं कि E10.5 मा पहिलो फरिन्जियल आर्कमा SPECC1L अभिव्यक्ति एपिथेलियम र अन्तर्निहित mesenchyme18 मा उपस्थित थियो, CNCC वंशसँग अनुरूप।CNCC मा SPECC1L अभिव्यक्ति परीक्षण गर्न, हामीले E8.5 न्यूरल फोल्डहरू (चित्र 4E-J) र E9.5 खोपडी खण्डहरू (चित्र 4K-) प्रदर्शन गर्यौं।E8.5 मा, SPECC1L ले एनसीसी मार्करहरू (Fig. 4G, J) को दाग भएका कोशिकाहरू सहित तीव्र रूपमा न्यूरल फोल्डहरू दाग गर्यो (चित्र 4E, H)।E9.5 मा, SPECC1L (Fig. 4K, N) AP2A (Fig. 4L, M) वा SOX10 (Fig. 4O, P) सँग सह-स्टेन्ड गरिएको माइग्रेट CNCC कडा दाग भएको छ।
(A) ES DTM096 (intron 1) र RRH048 (intron 15) सेल क्लोनहरूमा decoy भेक्टर सम्मिलन देखाउँदै माउस Specc11 जीनको योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व।(BD) Heterozygous Specc1lDTM096 भ्रूणको lacZ स्टेनिंग E8.5 देखि E10.5 सम्म Specc1l अभिव्यक्ति प्रतिनिधित्व गर्दछ।NE = neuroectoderm, NF = न्यूरल फोल्ड, PA1 = पहिलो ग्रसनी आर्क।(EP) E8.5 (NF; EJ) न्यूरल फोल्डहरू र E9.5 (KP) खोपडी खण्डहरूमा NCC मार्करहरू AP2A र SOX10 सँग SPECC1L इम्युनोस्टेनिङ।SPECC1L दाग व्यापक रूपमा न्यूरल फोल्ड्स E8.5 (E, H; arrowheads) मा अवलोकन गरिएको थियो, AP2A (F, G; arrowheads) र SOX10 (I, J; arrowheads) ले लेबल गरिएका सेलहरू सहित।E9.5 मा, SPECC1L मा AP2A (L, M; arrows) र SOX10 (O, P; arrows) लेबल गरिएका माइग्रेटिङ CNCCs (K, N; arrows) लाई कडा दाग लगाइएको छ।
heterozygous Specc1lDTM096/+ र Specc1lRRH048/+ मुसाहरू बीचको क्रसिङले देखाउँछ कि दुई जीन ट्र्याप एलिलहरू पूरक होइनन् र यौगिक हेटरोजाइगोटहरू र भ्रूण होमोजाइगोटहरू कुनै पनि जीन ट्र्याप एलिलका लागि भ्रूण घातक हुन्छन् (तालिका S1)।मेन्डेलियन अनुपातले जन्ममा हेटरोजाइगोटहरूको बाँच्ने दरमा कमी भएको संकेत गर्यो (अपेक्षित १.३४ बनाम २.०)।हामीले हेटेरोजाइगोटहरूमा कम प्रसव मृत्युदर नोट गर्यौं, कसै-कसैमा क्रेनियोफेसियल विसंगतिहरू थिए (चित्र S3)।यद्यपि, यी पेरिनेटल क्रेनियोफेसियल फेनोटाइपहरूको कम प्रवेशले तिनीहरूको अन्तर्निहित प्याथोफिजियोलोजिकल मेकानिजमहरू अध्ययन गर्न गाह्रो बनाउँछ।तसर्थ, हामीले homozygous Specc11 mutants को भ्रूण घातक phenotype मा ध्यान केन्द्रित गर्यौं।
अधिकांश यौगिक हेटेरोजाइगस वा होमोजिगस Specc1lDTM096/RRH048 उत्परिवर्ती भ्रूणहरू E9.5–10.5 (Figs. 5A-D) पछि विकसित भएनन्, र न्यूरल ट्यूब अगाडि बन्द भएन (Figs. 5B, D) र कहिलेकाहीँ पछाडि बन्द (देखाइएको छैन)। ।।यो क्रेनियल न्यूरल ट्यूब क्लोजर दोष E10.5 मा न्यूरल फोल्डहरूमा बाँकी रहेको CNCC चिन्हित DLX2 को बहुमतसँग सम्बन्धित थियो, कुनै विच्छेदन (चित्र 5A'-D') को संकेत गर्दैन।CNCC को समग्र आकार पनि घटाइएको छ कि छैन भनेर निर्धारण गर्न, हामीले Wnt1-Cre र ROSAmTmG सँग हाम्रो जीन ट्र्याप लाइनहरूमा GFP सँग CNCC लाइनहरू ट्याग गर्यौं।हामीले पूरै भ्रूणबाट क्रमबद्ध GFP+ NCC र GFP- (RFP+) गैर-NCC स्ट्रिम गर्छौं।E9.5 मा, प्रवाह-क्रमबद्ध GFP-लेबल CNCCs को अनुपात WT र उत्परिवर्ती भ्रूणहरू (देखाइएको छैन), सामान्य CNCC विशिष्टतालाई संकेत गर्ने बीचमा उल्लेखनीय परिवर्तन भएन।तसर्थ, हामीले परिकल्पना गर्यौं कि अवशिष्ट Wnt1-Cre र DLX2 स्टेनिङ एक्सपोज्ड न्यूरल फोल्डहरू (चित्र 5B') दोषपूर्ण CNCC लेयरिंगको कारणले भएको थियो, सम्भवतः SPECC1L-kd कोशिकाहरूमा देखिए अनुसार AJ कोशिकाहरूको घनत्व वा फैलावटको कारणले।हामीले NCC मार्करहरू SOX10, AP2A, र DLX2 को तंत्रिका तहमा CNCC को उपस्थिति पुष्टि गर्न प्रयोग गर्यौं (चित्र 5E-R)।E8.5 मा, WT (Fig. 5E, G, I) र Specc1l mutant (Fig. 5F, H, J) को खण्डहरूमा सबै तीन NCC मार्करहरूको लागि न्यूरल फोल्ड स्टेनिङ देखियो।E9.5 मा, NCC मार्करहरूले WT खण्डहरू (Fig. 5M, O, Q) मा माइग्रेट गर्ने NCC दाग लगाउँदा, Specc1l उत्परिवर्ती भ्रूणहरू (Fig. 5N, P, R) को खुला न्यूरल फोल्डहरूमा अवशिष्ट NCC दाग देखियो।किनकी SOX10 र DLX2 माइग्रेट CNCC हरू छन्, यो नतिजाले सुझाव दिन्छ कि SPECC1L-कम CNCC ले पोस्ट-माइग्रेटरी स्पेसिफिकेशन हासिल गर्छ तर न्यूरल फोल्डहरूबाट माइग्रेट गर्न असफल हुन्छ।
Specc11 को कमीले न्यूरल ट्युब क्लोजर, क्रेनियल न्यूरल क्रेस्ट सेल र AJs को डिलेमिनेशन निम्त्याउँछ।
(A, B') E9.5 WT (A) माइग्रेटिङ क्रेनियल न्यूरल क्रेस्ट सेल (CNCC) ले Wnt1-Cre (A') ले लेबल गरिएको भ्रूण।यसको विपरित, Specc11 उत्परिवर्ती भ्रूणहरूले ओपन न्यूरल फोल्डहरू (B), एरोहेडहरू) र CNCC हरू जुन स्थानान्तरण नगरिएका (B', एरोहेडहरू) देखाउँछन्।(C, D') E10.5 WT भ्रूण (C, C') र Specc1l (D, D') को CNCC मार्कर DLX2 को उज्यालो फिल्ड छविहरू (C, D') र इम्युनोस्टेनिङ (C', D')।WT E10.5 भ्रूणहरूमा, DLX2-positive CNCC ले गिल आर्चहरू (C', arrows) को उपनिवेश बनाउँछ, जबकि mutants मा, स्पष्ट दाग खुला न्यूरल फोल्डहरू (D', arrows) र पहिलो pharyngeal arches (D') मा रहन्छ। तीर)।) केही दागहरू (तीरहरू) संग कमजोर delamination र CNCC को माइग्रेसन संकेत गर्दछ।ER) चरणहरू E8.5 (E–L) र E9.5 (M–R) मा WT र Specc1l उत्परिवर्ती भ्रूणका खण्डहरूलाई NCC मार्करहरू SOX10 (E, F, M, N), AP2A (G, H,) सँग लेबल गरिएको थियो। O, P) र DLX2 (I, J, Q, R)।E8.5 मा, NCC दाग जंगली-प्रकार न्यूरल फोल्ड (NF) र उत्परिवर्ती खण्डहरूमा अवलोकन गरिएको थियो।E8.5 WT (K) र mutant (L) मा SOX10 र β-catenin को सह-स्टेनिङले न्यूरल फोल्डहरूमा सेल सीमाहरूमा β-catenin दाग बढेको खुलासा गर्‍यो।E9.5 मा, माइग्रेट CNCCs (M, O, Q) को जंगली-प्रकारको दाग देखियो, जबकि उत्परिवर्तीहरूमा, अस्तरीकृत CNCC हरूले खुला न्यूरल फोल्डहरू (N, P, R) दाग गरे।(S-Z) WT र Specc11DTM096/RRH048 E9.5 उत्परिवर्तनको साथ भ्रूणको कोरोनल खण्डहरूमा vivo AJ लेबलिङ विश्लेषण।माथिल्लो दायाँ कुनामा अनुमानित सेक्शनल प्लेन देखाइएको छ।उत्परिवर्ती तन्तुहरूको खण्डहरूमा, F-actin (S, T) र myosin IIb (U, V) को बढेको दाग देखियो।चित्र 3 मा भिट्रो परिणामहरू जस्तै, उत्परिवर्ती भ्रूणहरूमा, β-catenin (W, X) र E-cadherin (Y, Z) को लागि परिष्कृत झिल्ली दाग ​​देखियो।(AA-BB) जंगली-प्रकारको भ्रूणको खण्डको एक इलेक्ट्रोन माइक्रोग्राफले एपिकल-बेसल सेलको सिमाना बाहिर हेर्दा टाँसने जंक्शनहरू (एए, एरोहरू) को एक अलग इलेक्ट्रोन-घन क्षेत्र सूचक देखाउँछ।यसको विपरित, Specc11 उत्परिवर्ती भ्रूण (BB, arrows) को खण्डहरूमा, सम्पूर्ण एपिकोबासल जंक्शन इलेक्ट्रोन घना हुन्छ, जसले बढेको घनत्व र टाँसने जंक्शनहरूको फैलावटलाई संकेत गर्दछ।
परिवर्तन AJ को कारण लेयरिङ घटेको हो भन्ने हाम्रो परिकल्पना परीक्षण गर्न, हामीले Specc1l उत्परिवर्ती भ्रूण (Fig. 5S-Z) को खुला न्यूरल फोल्डहरूमा AJ लेबलिङ जाँच गर्यौं।हामीले एक्टिन तनाव फाइबर (Fig. 5S, T) र एक्टिन फाइबर (Fig. 5U, V) मा मायोसिन IIB दागको एक सहवर्ती बढेको स्थानीयकरण देख्यौं।महत्त्वपूर्ण रूपमा, हामीले इन्टरसेलुलर सीमाहरूमा β-catenin (Fig. 5W, X) र E-cadherin (Fig. 5Y, Z) को बढेको दाग देख्यौं।हामीले E8.5 भ्रूण (Fig. 5K, L) को न्यूरल फोल्डहरूमा NCC को β-catenin स्टेनिङ पनि जाँच्यौं।Specc1l म्युटेन्ट न्यूरल फोल्डहरू (चित्र 5L र K) मा β-catenin दाग बलियो देखिन्थ्यो, AJ परिवर्तनहरू सुरु भएको सुझाव दिन्छ।E9.5 भ्रूणहरूको खोपडी खण्डहरूको इलेक्ट्रोन माइक्रोग्राफहरूमा, हामीले फेरि WT (चित्र 5AA, BB र S1E-H) को तुलनामा Specc1l उत्परिवर्ती भ्रूणहरूमा फैलिएको इलेक्ट्रोन-घन दाग बढेको देख्यौं।सँगै लिएर, यी परिणामहरूले SPECC1L-kd U2OS कोशिकाहरूमा हाम्रो इन भिट्रो परिणामहरूलाई समर्थन गर्दछ र सुझाव दिन्छ कि हाम्रो उत्परिवर्ती भ्रूणहरूमा CNCC स्तरीकरणको अगाडि एबरेन्ट AJ दाग हुन्छ।
AKT गतिविधि र E-cadherin स्थिरता बीचको ज्ञात विरोधी सम्बन्धलाई दिईएको, 17,28 हामीले PI3K-AKT सिग्नलिङको संलग्नतालाई परिकल्पना गर्यौं।थप रूपमा, हामीले हाम्रा केही उत्परिवर्ती भ्रूणहरूमा सबपिडर्मल ब्लिस्टरिङ देख्यौं जुन E9.5-10.5 मा घातकता (<5%) बचेको थियो र यसको सट्टा लगभग E13.5 (चित्र S3) मा बसोबास गर्‍यो।Subepidermal vesicles PDGFRα12 मा आधारित कम PI3K-AKT सिग्नलिंग को एक विशेषता हो।Fantauzzo et al।(2014) रिपोर्ट गरियो कि PdgfraPI3K/PI3K उत्परिवर्ती भ्रूणहरूमा PDGFRα-आधारित PI3K सक्रियताको अवरोधले सबपिडर्मल भेसिकलहरू, न्यूरल ट्यूब दोषहरू, र क्लीफ्ट प्यालेट फेनोटाइपहरूमा परिणाम दिन्छ।वास्तवमा, प्यान-AKT र सक्रिय फास्फोरिलेटेड Ser473-AKT को स्तरहरू स्पेक1l उत्परिवर्ती ऊतकहरूमा E9.5 भ्रूण गिरफ्तारी (चित्र 6A-D) मा vivo मा घटाइयो।phosphorylated Ser473-AKT को स्तरमा कमी पूर्णतया भिभो (FIG. 6E) र in vitro (FIG. 6F) मा प्यान-AKT को स्तरमा कमीको कारण हुन सक्छ।जब U2OS कोशिकाहरू सेल आकार र AJ घनत्व (चित्र 6D) मा परिवर्तनहरूसँग मिल्दोजुल्दो थिए तब मात्र इन भिट्रोमा कमी देखियो।तसर्थ, हाम्रो डेटाले सुझाव दिन्छ कि SPECC1L क्रेनियोफेसियल मोर्फोजेनेसिसमा PI3K-AKT संकेतको उपन्यास सकारात्मक नियामक हो।
(A-E) E8.5 (A,B) र E9.5 (C,D) खोपडीका खण्डहरू वा Specc1l उत्परिवर्ती भ्रूण (E) बाट E9.5 lysates सक्रिय फास्फोरिलेटेड S473-AKT र प्यान-AKT प्रोटीन घटाउने स्तरहरू देखाउँदै। , नियन्त्रण WT को तुलनामा।पश्चिमी ब्लोटिंग जंगली-प्रकारको लाइसेट्स र उत्परिवर्ती लाइसेटहरूमा समान परिस्थितिहरूमा प्रदर्शन गरिएको थियो।SPECC1L का लागि देखाइएका तस्बिरहरू एउटा ब्लटबाट लिइएका थिए।एउटै धब्बा हटाइयो र एन्टि-प्यान-ACT र β-एक्टिन एन्टिबडीहरूसँग पुन: परीक्षण गरियो।E8.5 न्यूरल फोल्डहरू (A, B) मा प्यान-AKT स्तरहरू र E9.5 खोपडी खण्डहरूमा फास्फोरिलेटेड S473-AKT को स्तरहरू उल्लेखनीय रूपमा घटाइयो।(F) प्यान-AKT स्तरहरू उच्च संगममा काटिएका SPECC1L-kd U2OS कोषहरूको lysates मा समान रूपमा घटाइयो।त्रुटि पट्टीहरूले तीन स्वतन्त्र पश्चिमी ब्लट परिमाणहरूबाट SEM हरू प्रतिनिधित्व गर्दछ।(GJ) E9.5 मा WT भ्रूणहरूको खण्डहरू क्रमशः KI67 र क्लीव्ड क्यास्पेस 3 सँग दाग छन्, कोशिका प्रसार (G, G') र सानो अपोप्टोटिक गतिविधि (H, H') देखाउँदै।Specc11 उत्परिवर्ती भ्रूणले तुलनात्मक कोशिका प्रसार (I) देखाउँदछ, तर एपोप्टोसिसबाट गुज्रिएका कोशिकाहरूको संख्या उल्लेखनीय रूपमा बढेको छ (J)।
हामीले त्यसपछि प्रसार र एपोप्टोसिसको मार्करहरू जाँच्यौं।हामीले KI67 स्टेनिङ (p <0.56, Fisher's) द्वारा मापन गरिएको WT mutants को लागि 82.5% र Specc1l mutants को लागि 86.5% को प्रसार सूचकांकको साथ E9.5 भ्रूण (I को तुलनामा चित्र 6E, G) को प्रसारमा कुनै भिन्नता देखेनौं। सटीक परीक्षण)।त्यसै गरी, हामीले E8.5 मा न्यूरल फोल्डहरूमा क्लीभ्ड क्यास्पेस 3 को लागि दाग लगाएर मापन गरिएको एपोप्टोसिसमा कुनै भिन्नता देखेनौं जबसम्म भ्रूण पक्राउ (देखाइएको छैन) (देखाइएको छैन)।यसको विपरित, सबै E9.5 उत्परिवर्ती भ्रूण (चित्र 6F, H र J) मा एपोप्टोसिस उल्लेखनीय रूपमा बढेको थियो।एपोप्टोसिसमा यो समग्र वृद्धि कम PI3K-AKT संकेत र प्रारम्भिक भ्रूण घातकता 29,30,31 संग संगत छ।
अर्को, हाम्रो केडी कक्षहरूमा AJ परिवर्तनहरूमा PI3K-AKT संकेतको लागि कारण भूमिका पुष्टि गर्न, हामीले रासायनिक रूपमा नियन्त्रण र केडी कक्षहरूमा मार्ग परिवर्तन गर्‍यौं (चित्र 7A-F)।हामीले संगम SPECC1L-kd कक्षहरूमा अवलोकन गरिएको सेल आकार परिवर्तन फेनोटाइपलाई मार्करको रूपमा प्रयोग गर्‍यौं, जसलाई हामीले सबैभन्दा लामो आयाम (लम्बाइ) सँग सम्बन्धित ठाडो आयाम (चौडाइ) को अनुपात प्रयोग गरेर परिमार्जन गर्यौं।1 को अनुपात अपेक्षाकृत राउन्ड वा क्यूबोइडल कक्षहरू (चित्र 7G) को लागी अपेक्षित छ।सेल आकारको अतिरिक्त, हामीले AJ मा β-catenin staining (Fig. 7A'-F') द्वारा प्रभाव पुष्टि गर्यौं।wortmannin प्रयोग गरेर PI3K-AKT मार्गको अवरोध नियन्त्रण कक्षहरूमा सेल आकार परिवर्तन गर्न पर्याप्त थियो (चित्र 7A, C) र AJ (चित्र 7A')।PI3K-AKT एक्टिभेटर SC-79 ले सेल आकार (FIG। 7A, E) वा AJ विस्तार (FIG। 7A') नियन्त्रण कक्षहरूमा प्रभाव पारेन।SPECC1L-kd कोशिकाहरूमा, PI3K-AKT मार्गको थप दमनले एपोप्टोसिस (Fig. 7B,D) र β-catenin स्टेनिङ्ग (Fig. 7B') मा उल्लेखनीय वृद्धिको परिणामस्वरूप, हाम्रो in vivo भारी म्युटेन्टहरूसँग अनुरूप।महत्त्वपूर्ण रूपमा, PI3K-AKT मार्गको सक्रियताले सेल आकार (चित्र 7B,F) र AJ phenotypes (चित्र 7B") लाई उल्लेखनीय रूपमा सुधार गर्यो।सेल आकारमा परिवर्तनहरू सेल गोलाकार अनुपात (CCR) को रूपमा मापन गरियो र माथि वर्णन गरिए अनुसार महत्त्वको लागि तुलना गरियो (FIG। 7G)।वास्तवमा, नियन्त्रण कक्षहरूमा (चित्र। 7G, CCR = 1.56), वर्टम्यानिन उपचारले कोशिकाको आकार (चित्र 7G, CCR = 3.61, p <2.4 × 10-9) लाई देखाइएको जस्तै हदसम्म परिवर्तन गर्न पर्याप्त थियो। SPECC1L मा।-kd कक्षहरू (चित्र 7G, CCR = 3.46)।SPECC1L-kd कोशिकाहरूको Wortmannin उपचार (Fig. 7G, CCR = 3.60, negligible) उपचार नगरिएका kd कोशिकाहरू (Fig. 7G, CCR = 3.46, नगण्य) वा wortmannin-उपचार नियन्त्रण कक्षहरू (Fig. 7G) भन्दा बढी महत्त्वपूर्ण थिएन।, CCR = 3.46, नगण्य) थप रूपमा सेल लम्बाइलाई असर गर्छ (7G, CCR = 3.61, नगण्य)।सबैभन्दा महत्त्वपूर्ण कुरा, SC-79 AKT एक्टिभेटरले SPECC1L-kd कक्षहरूको लामो फेनोटाइप पुनर्स्थापित गर्‍यो (चित्र 7G, CCR = 1.74, p <6.2 × 10-12)।यी नतिजाहरूले पुष्टि गर्दछ कि SPECC1L PI3K-AKT सिग्नलिङलाई नियमन गर्दछ र सुझाव दिन्छ कि SPECC1L मा मध्यम कमीले सेल आसंजनलाई असर गर्छ, जबकि बलियो कमीले एपोप्टोसिस (चित्र 8) निम्त्याउँछ।
(A-F') नियन्त्रण (A, C, E) र SPECC1L-kd (B, D, F) कोशिकाहरू PI3K-AKT मार्ग अवरोधक वर्टम्यानिन (C, D) वा SC-79 एक्टिभेटर (E, F) उपचारसँग उपचार गरिन्छ। उपचार नगरिएका नियन्त्रण कक्षहरू सामान्य β-बिरालाको सेलुलर स्टेनिङ (A') सँग क्युबोइडल (A) हुन्छन्, जबकि kd कोशिकाहरू लम्बाइ (B) β-बिरालाको दाग (B') को साथमा हुन्छन्।PI3K-AKT मार्गको दमन पछि, नियन्त्रण कक्षहरू β-बिराला विस्तार (C') संग लम्बाइ (C) लम्बियो, जबकि kd कोशिकाहरूले एपोप्टोसिस (D) गुजर्न थाले, हाम्रो अत्यधिक उत्परिवर्तित भ्रूणहरू जस्तै र अत्यन्त परिष्कृत β-बिराला देखाउँदै।दाग (D')।PI3K-AKT मार्गको सक्रियता पछि, नियन्त्रण कक्षहरू क्यूबोइडल (E) रह्यो र सामान्य β-बिराला (E') दाग थियो, जबकि kd कक्षहरूले उल्लेखनीय रूपमा सुधारिएको सेल आकार (F) र β-बिराला (F') दाग देखायो, संकेत गर्दै। (G) सेल आकार परिवर्तनको डिग्री (AF) सबैभन्दा लामो आयाम (लम्बाइ) को सेल गोलाकार अनुपात (CCR) र MetaMorph सफ्टवेयर प्रयोग गरी सम्बन्धित ठाडो आयाम (चौडाइ) प्रयोग गरेर परिमाण गरिएको थियो।उपचार नगरिएको (NT) SPECC1L-kd कक्षहरू (CCR = 3.46) नियन्त्रण कक्षहरू (CCR = 1.56, p <6.1 × 10-13) भन्दा धेरै लामो थिए।नियन्त्रण कक्षहरूमा PI3K-AKT मार्गको Wort को अवरोध सेल आकार (CCR=3.61, p <2.4×10-9) मा समान विस्तारको कारण पर्याप्त थियो।त्यसैगरी, SPECC1L-kd कक्षहरूमा SC-79 द्वारा AKT सक्रियताले नियन्त्रण स्तरहरूमा सेल लम्बाइ पुनर्स्थापित गर्‍यो (CCR = 1.74, p <6.2 × 10-12)।SPECC1L-kd कोशिकाहरूको वोर्टम्यानिन उपचारले एपोप्टोसिस बढ्यो तर उपचार नगरिएको केडी (सीसीआर = 3.46, एनएस) वा वर्टम्यानिन-उपचार गरिएका नियन्त्रण कक्षहरू (3.61) को तुलनामा सेल आकार परिवर्तन (सीसीआर = 3.60) मा थप वृद्धि भएको छैन।ns = फरक पर्दैन।+/- ५० कक्षहरूको लागि SEM मापन देखाइएको छ।विद्यार्थीको टी-टेस्ट प्रयोग गरेर तथ्याङ्कीय भिन्नताहरू गणना गरियो।
(A) क्रमशः AJ परिवर्तन र उद्धारमा PI3K-AKT मार्गको अवरोध र सक्रियताको योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व।(B) SPECC1L द्वारा AKT प्रोटीन स्थिरीकरणको लागि प्रस्तावित मोडेल।
प्रिमिग्रेटरी CNCCs लाई पूर्ववर्ती न्यूरल फोल्ड न्यूरोएपिथेलियल सेलहरू १,१५,३२ बाट अलग गर्न AJ lysis आवश्यक हुन्छ।AJ कम्पोनेन्टहरूको बढ्दो दाग र SPECC1L-कम कोशिकाहरूमा apical-basal AJ असममित वितरणको हानि दुवै भिट्रो र vivo मा, SPECC1L को β-catenin को भौतिक निकटतासँग मिलाएर, सुझाव दिन्छ कि SPECC1L कार्यहरू AJ स्थानीय स्थिरताको लागि ठीकसँग कायम राख्न। संगठन मांसपेशिहरु।एक्टिन साइटोस्केलेटन।एक्टिन साइटोस्केलेटन र β-केटिनिनसँग SPECC1L को सम्बन्ध र SPECC1L को अनुपस्थितिमा कन्डेन्स्ड एक्टिन फिलामेन्टहरूको संख्यामा भएको वृद्धि AJ घनत्वमा देखाइएको वृद्धिसँग अनुरूप छ।अर्को सम्भावना भनेको SPECC1L-कम कोशिकाहरूमा एक्टिन फाइबरको बढ्दो संख्याले इन्टरसेलुलर तनावमा परिवर्तन निम्त्याउँछ।किनकि सेलुलर तनावले AJ 33 गतिशीलतालाई असर गर्छ, भोल्टेज परिवर्तनहरूले AJ 34 को अधिक फैलाउन सक्छ।त्यसैले कुनै पनि परिवर्तनले CNCC तहहरूलाई असर गर्नेछ।
Wnt1 प्रारम्भिक तंत्रिका तहहरूमा व्यक्त गरिएको छ जसले तंत्रिका क्रेस्ट कोशिकाहरूलाई जन्म दिन्छ।यसरी, Wnt1-cre वंश ट्रेसिङले NCC35 पूर्व र माइग्रेट गर्ने दुवैलाई चिन्ह लगाउँछ।यद्यपि, Wnt1 ले प्रारम्भिक न्यूरल फोल्डहरू 35,36 बाट व्युत्पन्न पृष्ठीय मस्तिष्क टिस्यु क्लोनहरूलाई पनि चिन्ह लगाउँदछ, यसले खुला न्यूरल फोल्डहरूमा Wnt1 मार्करहरूको लागि E9.5 म्युटेन्टहरूको दाग CNCC नभएको सम्भावना बनाउँछ।NCC मार्करहरू AP2A र SOX10 को लागि हाम्रो सकारात्मक दागले पुष्टि गर्‍यो कि Specc11 उत्परिवर्ती भ्रूणहरूको खुला न्यूरल फोल्डहरूमा वास्तवमा CNCC समावेश थियो।थप रूपमा, AP2A र SOX10 प्रारम्भिक माइग्रेट NCC को मार्करहरू हुनाले, सकारात्मक दागले संकेत गर्छ कि यी कोशिकाहरू पोस्ट-माइग्रेट CNCC हुन् जसलाई E9.5 द्वारा स्तरीकृत गर्न सकिँदैन।
हाम्रो डेटाले सुझाव दिन्छ कि SPECC1L द्वारा AJ को आणविक नियमन PI3K-AKT सिग्नलिंग द्वारा मध्यस्थता गरिएको छ।AKT सिग्नलिङ SPECC1L को कमी भएका कोशिका र तन्तुहरूमा कम हुन्छ।Fantauzzo et al द्वारा खोजहरू।क्र्यानोफेसियल मोर्फोजेनेसिसमा PI3K-AKT संकेतको लागि प्रत्यक्ष भूमिकालाई समर्थन गर्नुहोस्।(2014) देखाइयो कि PDGFRα-आधारित PI3K-AKT सिग्नलिंगको सक्रियताको अभावले क्लीफ्ट तालु फेनोटाइपमा जान्छ।हामी यो पनि देखाउँछौं कि PI3K-AKT मार्गको अवरोध U2OS कक्षहरूमा AJ र सेल आकार परिवर्तन गर्न पर्याप्त छ।हाम्रो निष्कर्ष संग संगत, Cain et al।37 ले देखायो कि एन्डोथेलियल कोशिकाहरूमा PI3K α110 सबयुनिटको डाउनरेगुलेसनले पेरिसेल्युलर β-केटिनिन स्टेनिङमा समान वृद्धि हुन्छ, जसलाई "कनेक्टिभिटी इन्डेक्स" मा वृद्धि भनिन्छ।यद्यपि, एन्डोथेलियल कोशिकाहरूमा जसको एक्टिन फिलामेन्टहरू पहिले नै अत्यधिक व्यवस्थित छन्, PI3K-AKT मार्गको दमनले सेल आकारमा ढीलो परिणाम दिन्छ।यसको विपरित, SPECC1L-kd U2OS कोशिकाहरूले लामो सेल आकार देखाए।यो भिन्नता सेल प्रकार विशिष्ट हुन सक्छ।जबकि PI3K-AKT सिग्नलिङको दमनले स्थायी रूपमा एक्टिन साइटोस्केलेटनलाई असर गर्छ, सेल आकारमा प्रभाव केन्द्रीय एक्टिन फाइबरको घनत्व र संगठनमा परिवर्तनको कारण तनावमा परिवर्तनहरूद्वारा निर्धारण गरिन्छ।U2OS कक्षहरूमा, हामीले SPECC1L-कम एजे परिवर्तन र रिकभरीको मार्करको रूपमा मात्र सेल आकार परिवर्तनहरू प्रयोग गर्यौं।निष्कर्षमा, हामी परिकल्पना गर्छौं कि SPECC1L को कमीमा AKT मार्गको अवरोधले AJ स्थिरता बढाउँछ र CNCC मा delamination घटाउँछ।
चाखलाग्दो कुरा के छ भने, PAN-AKT स्तरहरू AKT प्रोटीन स्थिरता वा टर्नओभरको स्तरमा PI3K-AKT संकेतको नियमनलाई सुझाव दिँदै, SPECC1L को अनुपस्थितिमा phosphorylated 473-AKT स्तरहरूको अतिरिक्त भिट्रो र vivo मा घटाइएको थियो।SPECC1L र MID1 जीनहरू, दुबै Opitz/GBBB सिन्ड्रोमसँग सम्बन्धित छन्, प्रोटिनहरू इन्कोड गर्दछ जसले माइक्रोट्यूब्युल 18,22 लाई स्थिर गर्दछ।SPECC1L र MID1 ले माइक्रोट्यूब्युल स्थिरीकरणको मध्यस्थता गर्ने मेकानिजम पूर्ण रूपमा बुझिएको छैन।SPECC1L को मामलामा, यो स्थिरीकरणमा माइक्रोट्यूब्युल 18 को सबसेटको परिष्कृत एसिटिलेशन समावेश छ।यो सम्भव छ कि SPECC1L ले AKT जस्ता अन्य प्रोटीनहरूलाई स्थिर गर्न समान संयन्त्र प्रयोग गर्दछ।यो देखाइएको छ कि AKT प्रोटिनमा लाइसिन अवशेषहरूको एसिटिलेशनले झिल्ली स्थानीयकरण र फास्फोरिलेसन 38 मा कमी निम्त्याउँछ।थप रूपमा, AKT मा समान लाइसिन अवशेषमा K63 चेनको सर्वव्यापीकरण यसको झिल्ली स्थानीयकरण र सक्रियता 39,40 को लागि आवश्यक छ।विभिन्न उच्च थ्रुपुट यीस्ट दुई-हाइब्रिड स्क्रिनहरूमा पहिचान गरिएका SPECC1L प्रोटीनहरूसँग अन्तर्क्रिया गर्ने धेरै कारकहरू मध्ये, चार - CCDC841, ECM2942, APC र UBE2I43 - प्रोटिन कारोबार वा सर्वव्यापीता वा समोयलेशन मार्फत स्थिरतामा संलग्न छन्।SPECC1L AKT लाइसिन अवशेषहरूको पोस्ट-अनुवादात्मक परिमार्जनमा संलग्न हुन सक्छ, जसले AKT स्थिरतालाई असर गर्छ।यद्यपि, AKT प्रोटीनको स्थानीयकरण र स्थिरतामा SPECC1L को महत्वपूर्ण भूमिका स्पष्ट हुन बाँकी छ।
Vivo मा SPECC1L अभिव्यक्तिमा गम्भीर दोषहरूको परिणामस्वरूप AJ मार्कर दाग र दोषपूर्ण CNCC ओभरले, साथै एपोप्टोसिस र प्रारम्भिक भ्रूण घातकता बढ्यो।अघिल्लो रिपोर्टहरूले देखाएको छ कि एपोप्टोसिसको बढ्दो स्तरका साथ माउस म्युटेन्टहरू न्यूरल ट्यूब दोषहरू 44,45,46,47 र क्रेनियोफेसियल दोषहरू 48 सँग सम्बन्धित छन्।यो सुझाव दिइएको छ कि तंत्रिका तह वा फरिन्जियल आर्चहरूमा अत्यधिक कोशिकाको मृत्युले उचित मोर्फोजेनेटिक आन्दोलन 48,49,50 को लागि आवश्यक कोशिकाहरूको अपर्याप्त संख्या हुन सक्छ।यसको विपरित, हाम्रो SPECC1L कमजोर सेल लाइनहरू मध्यम रूपमा घटाइएको SPECC1L अभिव्यक्तिले सेल मृत्युको प्रमाण बिना मात्र AJ परिवर्तनहरू देखायो।जे होस्, यी Kd कोशिकाहरूमा PI3K-AKT मार्गको रासायनिक अवरोधले एपोप्टोसिस बढ्यो।यसरी, SPECC1L अभिव्यक्ति वा प्रकार्यमा एक मध्यम कमीले सेल अस्तित्व सुनिश्चित गर्दछ।यो अवलोकन संग संगत छ कि दुर्लभ Specc11 उत्परिवर्ती भ्रूण जो st.E9.5 — हुनसक्छ जीन क्याप्चर दक्षता कम भएको कारणले — तिनीहरूको न्यूरल ट्युबहरू बन्द गर्न र पछि विकासमा रोक्न सक्षम हुन्छन्, प्रायः क्र्यानोफेसियल दोषहरू (चित्र S3) संग।योसँग पनि मिल्दोजुल्दो हेटरोजाइगस स्पेक१एल भ्रूणको क्रेनियोफेसियल असामान्यताहरू भएको दुर्लभ घटना हो - सम्भवतः बढेको जीन क्याप्चर दक्षताका कारणले - साथै जेब्राफिसमा फेला परेको जसमा दुई SPECC1L ओर्थोलगहरू (specc1lb) मध्ये एउटाले एम्ब्रोटको क्षतिको कारण बनाउँछ। तल्लो जबडा र द्विपक्षीय फाट51।यसैले, मानव रोगीहरूमा पहिचान गरिएको हेटरोजाइगस SPECC1L हानि-अफ-फंक्शन उत्परिवर्तनहरूले क्र्यानोफेसियल मोर्फोजेनेसिसको समयमा SPECC1L प्रकार्यमा सानो कमजोरीहरू निम्त्याउन सक्छ, तिनीहरूको ओरोफेसियल क्लेफ्टहरू व्याख्या गर्न पर्याप्त छ।इन्टरसेलुलर सम्पर्कहरूको SPECC1L-आधारित नियमनले पनि palatogenesis र pharyngeal arches को फ्यूजनमा भूमिका खेल्न सक्छ।SPECC1L प्रकार्यको थप अध्ययनले न्यूरोएपिथेलियल सेल गतिशीलता र क्रेनियोफेसियल मोर्फोजेनेसिसमा न्यूरल ट्यूब बन्द हुँदा CNCC मा अस्थायी इन्टरसेलुलर सम्पर्कहरूको भूमिकालाई स्पष्ट गर्न मद्दत गर्नेछ।
U2OS osteosarcoma नियन्त्रण र SPECC1L-kd कोशिकाहरू पहिले वर्णन गरिएको छ (सादी एट अल।, 2011)।SPECC1L विरुद्ध एन्टिबडीहरू पहिले पनि विशेषता गरिएको छ (सादी एट अल।, 2011)।एन्टी-बीटा-केटिनिन एन्टिबडीहरू (खरगोश; 1:1000; सान्ता क्रुज, डलास, TX) (माउस; 1:1000; सेल सिग्नलिङ टेक्नोलोजी, डेनभर्स, MA), मायोसिन IIb (1:1000; सिग्मा-एल्ड्रिच, सेन्ट लुइस) ) , MO) ), E-cadherin (1:1000; Abkam, Cambridge, MA), AP2A (1:1000; Novus Biologicals, Littleton, Colo.), SOX10 (1:1000; 1000; Aviva Systems Biology, San Diego , क्यालिफोर्निया), DLX2 (1:1000; Abcam, Cambridge, MA), phospho-Ser473-AKT (1:1000; सेल सिग्नलिङ टेक्नोलोजी, Danvers, MA), pan-AKT (1:1000; ThermoFisher Scientific, Waltham, MA) ) , KI67 (1:1000; सेल सिग्नलिङ टेक्नोलोजी, Danvers, MA), क्लीभ्ड क्यास्पेस 3 (1:1000; सेल सिग्नलिङ टेक्नोलोजी, डेनभर्स, MA) र β-actin (1:2500; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) वर्णन गरिएको रूपमा प्रयोग गरिएको थियो।।एक्टिन फिलामेन्टहरू Acti-stain rhodamine phalloidin (Cytoskeleton, Denver, Colorado) सँग दाग थिए।
U2OS नियन्त्रण कक्षहरू र SPECC1L-kd कोशिकाहरूलाई मानक उच्च ग्लुकोज DMEM मा 10% भ्रूण बोवाइन सीरम (लाइफ टेक्नोलोजीहरू, कार्ल्सब्याड, CA) को साथ पूरक गरिएको थियो।AJ परिवर्तनहरूको लागि, 0.1% पोर्सिन जिलेटिन (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) सँग उपचार गरिएको गिलासमा 2 x 105 कक्षहरू सीड गरियो र सेल आकारमा परिवर्तनहरूको लागि अवलोकन गरियो।कक्षहरू विभिन्न संकेत गरिएको समय बिन्दुहरूमा सङ्कलन गरिएको थियो: बीउ रोपेको 4 घण्टा पछि (t = 1), बीउ रोपेको 24 घण्टा पछि (t = 2), सेल आकारमा परिवर्तन बिना संगम (t = 3), सेल आकारमा परिवर्तन (t = 4) , सेल आकार परिवर्तन पछि 24 घन्टा (t = 5) र 48 घन्टा पछि सेल आकार परिवर्तन (t = 6) (चित्र 1, 2, 3)।PI3K-AKT मार्ग परिमार्जन गर्न कोशिकाहरूलाई PI3K-AKT अवरोधक वर्टम्यानिन (TOCRIS Biosciences, Minneapolis, Minnesota) वा SC-79 activator (TOCRIS Biosciences, Minneapolis Adams, Minnesota Adams) सँग संकेतित एकाग्रतामा संवर्धित गरिएको थियो।रसायन युक्त माध्यम दैनिक परिवर्तन भएको थियो।
फ्रेम-द्वारा-फ्रेम रेकर्डिङहरू प्रत्यक्ष नियन्त्रण र KD कक्षहरूमा सामान्य संस्कृति अवस्थाहरूमा बनाइयो, र चरण कन्ट्रास्ट छविहरू 7 दिनको लागि प्रत्येक 10 मिनेटमा सङ्कलन गरियो।तस्बिरहरू कम्प्युटर-नियन्त्रित Leica DM IRB इन्भर्टेड माइक्रोस्कोप प्रयोग गरेर प्राप्त गरियो जुन मेकानिकल स्टेज र 10 × N-PLAN उद्देश्यले QImaging Retiga-SRV क्यामेरामा जडान गरिएको थियो।इमेजिङको क्रममा, 5% CO2 संग आर्द्र वातावरणमा 37 डिग्री सेल्सियसमा सेल कल्चरहरू राखिएको थियो।
क्षेत्रीय म्युटेन्ट माउस रिसोर्स सेन्टर (UC Davis, CA) बाट दुई जीन ट्र्याप ES सेल लाइनहरू DTM096 र RRH048 Specc11 कमजोर माउस लाइनहरू उत्पन्न गर्न प्रयोग गरियो, निर्दिष्ट गरिएको Specc1lgtDTM096 र Specc1lgtRRH046।छोटकरीमा, 129/REJ ES कोशिकाहरूलाई C57BL6 ब्लास्टोसिस्टमा इन्जेक्सन गरिएको थियो।अगाउटी कोट रङ भएका सन्तानहरू पहिचान गर्न नतिजा प्राप्त हुने काइमेरिक नर मुसालाई महिला C57BL6 मुसाहरूसँग प्रजनन गरिएको थियो।जीन ट्र्याप भेक्टर इन्सर्टको उपस्थिति हेटेरोजाइगोट्स पहिचान गर्न प्रयोग गरिएको थियो।मुसाहरू 129/REJ; C57BL6 को मिश्रित पृष्ठभूमिमा राखिएको थियो।आनुवंशिक जाल भेक्टरको सम्मिलित साइटको स्थान RT-PCR, जीनोम अनुक्रम, र आनुवंशिक पूरक (पूरक चित्र 1) द्वारा पुष्टि गरिएको थियो।डबल heterozygous Specc1lGT चूहों को CNCC वंश ट्रेस गर्न को लागी, ROSAmTmG (#007576) र Wnt1-Cre (#003829) मुसा (ज्याक्सन प्रयोगशाला, बार हार्बर, ME) लाई ROSAmTmG र Wnt1-Crecry 1-Creosl सबै एम्बुलेन्ट उत्पादन गर्न पार गरियो।चूहों मा सबै प्रयोग कन्सास मेडिकल सेन्टर विश्वविद्यालय को संस्थागत पशु हेरचाह र उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित प्रोटोकल अनुसार प्रदर्शन गरिएको थियो।
भ्रूणहरूलाई कोठाको तापक्रममा ६० मिनेटको लागि (१% फर्माल्डिहाइड, ०.२% ग्लुटाराल्डिहाइड, २ mM MgCl2, ०.०२% NP-40, 5 mM EGTA) मा फिक्स गरिएको थियो।X-gal स्टेनिङ्ग समाधानमा फिक्सेसन पछि (5 mM पोटासियम फेरीसाइनाइड, 5 mM पोटासियम फेरोसायनाइड, 2 mM MgCl2, 0.01% सोडियम deoxycholate, 0.02% NP-40, 1 mg/ml X-gal) दाग विकास 3 ° C मा प्रदर्शन गरिएको थियो। ।1-6 घण्टा भित्र °C।भ्रूणहरू 4% PFA मा पोस्ट-फिक्स गरिएको थियो र कल्पना गरिएको थियो।
पश्चिमी ब्लोटिंगको लागि, कोशिकाहरूलाई निष्क्रिय लिसिस बफर (प्रोमेगा, फिचबर्ग, WI) मा HALT प्रोटीज अवरोधकहरू (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) को मिश्रणको साथ पूरक गरिएको थियो।Lysates 12% polyacrylamide Mini-PROTEAN TGX रेडीमेड जेल (बायो-राड, हर्कुलस, CA) मा प्रशोधन गरियो र Immobilon PVDF झिल्ली (EMD Millipore, Billerica, MA) मा हस्तान्तरण गरियो।PBS मा 0.1% Tween भएको 5% दूधमा झिल्लीहरू अवरुद्ध थिए।एन्टिबडीहरू रातभर 4 डिग्री सेल्सियसमा वा कोठाको तापक्रममा एक घण्टाको लागि इन्क्युबेटेड गरियो।Femto SuperSignal West ECL अभिकर्मक (थर्मो साइन्टिफिक, वाल्थम, एमए) संकेत उत्पादनको लागि प्रयोग गरिएको थियो।इम्युनोस्टेनिङको लागि, भ्रूणहरू 4% PFA/PBS मा रातारात फिक्स गरियो र क्रायोप्रिजर्व गरियो।Tsue cryosections PBS मा 1% सामान्य बाख्रा सीरम (थर्मो साइन्टिफिक, वाल्थम, MA) र 0.1% ट्राइटन X-100 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) भएको अवरुद्ध गरियो र त्यसपछि इन्क्यूबेटरमा 4°C मा इन्क्युबेट गरियो। रात।एन्टी-एन्टिबडी र फ्लोरोसेन्ट सेकेन्डरी एन्टिबडी (1:1000) 1 घण्टाको लागि 4°C मा।दाग भएका खण्डहरू प्रोलोङ सुनको माध्यम (थर्मो साइन्टिफिक, वाल्थम एमए) मा राखिएको थियो र लेइका टीसीएस एसपीई कन्फोकल माइक्रोस्कोप प्रयोग गरेर फ्ल्याट छविहरू प्राप्त गरियो।प्रत्येक इम्युनोस्टेनिङ कम्तिमा दुई उत्परिवर्ती भ्रूणहरूको सिरोसेक्शनहरूमा तीन स्वतन्त्र प्रयोगहरूको रूपमा प्रदर्शन गरिएको थियो।एक प्रतिनिधि प्रयोग देखाइएको छ।
कक्षहरू परिमार्जित RIPA बफर (20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1% NP-40, 130 mM NaCl, 10% ग्लिसरोल, 2 mM EDTA, र HALT प्रोटीज अवरोधक (सिग्मा-एल्ड्रिच, सेन्ट लुई) मा इन्क्युबेटेड थिए। छोटकरीमा, लाइसेट्सलाई प्रोटिन G चुम्बकीय मोती (लाइफ टेक्नोलोजी, कार्ल्सब्याड, CA) द्वारा प्रिप्रिफाइड गरिएको थियो र त्यसपछि 4° C मा रातभर इन्क्युबेटेड एन्टि-SPECC1L वा IgG प्रोटीन G प्रोटीन मोतीहरू प्रयोग गरी SPECC1L निकाल्न प्रयोग गरिएको थियो र पश्चिमी ब्लटिंग एन्टिको प्रयोग गरी गरिएको थियो। माथि वर्णन गरिएको -β-catenin एन्टिबडी देखाइएको सह-आईपी प्रयोगहरू चार स्वतन्त्र प्रयोगहरूको प्रतिनिधि हुन्।
कन्सास मेडिकल सेन्टर युनिभर्सिटीको इलेक्ट्रोन माइक्रोस्कोपी सेन्टरमा फिक्स्ड कल्चर्ड सेल वा माउस भ्रूण ऊतकहरू प्रदान गरियो।संक्षेपमा, नमूनाहरू EMbed 812 राल (इलेक्ट्रोन माइक्रोस्कोपी विज्ञान, फोर्ट वाशिंगटन, PA) मा एम्बेड गरिएको थियो, रातभर 60 डिग्री सेल्सियसमा पोलिमराइज गरिएको थियो, र हीरा ब्लेडले सुसज्जित Leica UC7 अल्ट्रामाइक्रोटोम प्रयोग गरेर 80 एनएममा सेक्शन गरिएको थियो।खण्डहरू 100 kV Lab6 बन्दुकले सुसज्जित JEOL JEM-1400 ट्रान्समिशन इलेक्ट्रोन माइक्रोस्कोप प्रयोग गरेर कल्पना गरिएको थियो।
यो लेख कसरी उद्धृत गर्ने: विल्सन, एनआर एट अल।SPECC1L को कमीले टुक्रिएको जोर्नीहरूको स्थिरता बढाउँछ र क्रेनियल न्यूरल क्रेस्ट कोशिकाहरूको डेलामिनेशन घटाउँछ।विज्ञान।६, १७७३५;doi:10.1038/srep17735 (2016)।
सेन्ट-जीन, जे-पी।न्यूरल क्रेस्ट को प्रेरण र भिन्नता।(स्प्रिंगर साइंस + बिजनेस मिडिया; ल्यान्डेस बायोसाइन्स/Eurekah.com, 2006)।
Cordero, DR et al।क्रेनियल न्यूरल क्रेस्ट सेलहरू गतिमा: क्रेनियोफेसियल विकासमा तिनीहरूको भूमिका।अमेरिकन जर्नल अफ मेडिकल जेनेटिक्स।भाग A 155A, 270-279, doi:10.1002/ajmg.a.33702 (2011)।
बोल्याण्ड, आरपी न्यूरोक्रिस्टोपाथिया: यसको वृद्धि र विकास 20 वर्षमा।बाल रोग विशेषज्ञ।रोगविज्ञान।प्रयोगशाला।औषधी।१७, १–२५ (१९९७)।
मङ्गोल्ड ई., लुडविग केयू र नोटेन एमएम ब्रेकथ्रु ओरोफेसियल क्लेफ्ट्सको आनुवंशिकीमा।आणविक चिकित्सा 17, 725–733, doi:10.1016/j.molmed.2011.07.007 (2011) मा प्रवृत्तिहरू।
मिनु, एम. र रिले, क्रेनियोफेसियल विकासको क्रममा क्रेनियल न्यूरल क्रेस्ट सेल माइग्रेसन र ढाँचाको एफएम आणविक संयन्त्र।विकास 137, 2605–2621, doi: 10.1242/dev.040048 (2010)।
डिक्सन, MJ, Marazita, ML, Beaty, TH र Murray, JK Cleft lip and palate: बुझ्दै आनुवंशिक र वातावरणीय प्रभावहरू।स्वाभाविक टिप्पणी।आनुवंशिकी 12, 167–178, doi: 10.1038/nrg2933 (2011)।
Ingram, CR et al।इन्टरफेरोन-रेगुलेटिंग कारक-6 (Irf6) मा छाला, अंगहरू, र क्रेनियोफेसियल क्षेत्रको असामान्य मोर्फोजेनेसिस - अभाव मुसा।राष्ट्रिय जेनेट।38, 1335–1340, doi: 10.1038/ng1903 (2006)।
Peyrard-Janvid, M. et al।GRHL3 मा प्रभावशाली उत्परिवर्तनले भ्यान डर वार्ड सिन्ड्रोमको कारण बनाउँछ र मौखिक पेरिडर्मको विकासलाई कमजोर बनाउँछ।Am J Hum Genet 94, 23-32, doi: 10.1016/j.ajhg.2013.11.009 (2014)।
ह्यारिस, MJ र Juriloff, DM न्यूरल ट्यूब क्लोजरमा त्रुटिहरू भएका माउस म्युटेन्टहरूको सूची अपडेट गर्नुहोस् र न्यूरल ट्यूब बन्दको पूर्ण आनुवंशिक समझ तर्फ प्रगति गर्नुहोस्।जन्म दोषहरूको अनुसन्धान।भाग A, क्लिनिकल र आणविक टेराटोलोजी 88, 653–669, doi: 10.1002/bdra.20676 (2010)।
Fantauzzo, KA र Soriano, P. PI3K-मध्यस्थता PDGFRalpha सिग्नलिङले p53-निर्भर इन्ट्रासेलुलर मार्ग मार्फत कंकाल विकासमा अस्तित्व र प्रसारलाई नियमन गर्दछ।जीन विकास 28, 1005-1017, doi: 10.1101/gad.238709.114 (2014)।
कोप, एजे, ग्रीन, एनडी र मर्डोक, जेएन डिशेवेल्ड: न्यूरल ट्यूब बन्द गर्न अभिसरण विस्तारको सम्बन्ध।न्यूरोलोजी मा प्रवृत्ति।26, 453–455, doi: 10.1016/S0166-2236(03) 00212-1 (2003)।