347 स्टेनलेस स्टील कोइल्ड ट्युबिङ रासायनिक घटक, क्रस-लिंक्ड मास स्पेक्ट्रोमेट्री (CLMS) को प्रयोग गरेर उपन्यास इन्टरफेरोन-उत्तरदायी मानव ल्युकोसाइट एन्टिजेन-ए (HLA-A) चेपेरोन प्रोटीनहरूको पहिचान।

Nature.com भ्रमण गर्नुभएकोमा धन्यवाद।तपाईं सीमित CSS समर्थनको साथ ब्राउजर संस्करण प्रयोग गर्दै हुनुहुन्छ।उत्तम अनुभवको लागि, हामी तपाईंलाई अपडेट गरिएको ब्राउजर प्रयोग गर्न सिफारिस गर्छौं (वा इन्टरनेट एक्सप्लोररमा अनुकूलता मोड असक्षम गर्नुहोस्)।थप रूपमा, निरन्तर समर्थन सुनिश्चित गर्न, हामी शैलीहरू र जाभास्क्रिप्ट बिना साइट देखाउँछौं।
स्लाइडरहरू प्रति स्लाइड तीन लेखहरू देखाउँदै।स्लाइडहरू मार्फत सार्नको लागि पछाडि र अर्को बटनहरू प्रयोग गर्नुहोस्, वा प्रत्येक स्लाइडमा सार्नको लागि अन्तमा स्लाइड नियन्त्रक बटनहरू प्रयोग गर्नुहोस्।

उत्पादन विवरण

स्टेनलेस स्टील 347L कुंडल ट्यूब, स्टील ग्रेड: SS347L

इन्टरफेरोन सिग्नलिंग प्रणालीले वातावरणबाट रोगजनक र आन्तरिक रोगविज्ञान संकेतहरूको विस्तृत श्रृंखलामा बलियो साइटोकाइन प्रतिक्रियालाई प्रेरित गर्दछ, परिणामस्वरूप इन्टरफेरोन-इन्ड्युसिबल प्रोटीनहरूको सबसेटहरू समावेश गर्दछ।हामीले इन्टरफेरोन-प्रेरित प्रोटीनहरूको डोमेनमा नयाँ प्रोटीन-प्रोटिन अन्तरक्रियाहरू पत्ता लगाउन DSS-मध्यस्थ क्रस-लिङ्क मास स्पेक्ट्रोमेट्री (CLMS) लागू गर्यौं।अपेक्षित इन्टरफेरोन-इन्ड्युसिबल प्रोटीनहरूको अतिरिक्त, हामीले क्यानोनिकल इन्टरफेरोन-इन्ड्युसिबल प्रोटीनहरू जस्तै MX1, USP18, OAS3, र STAT1 को उपन्यास इन्टरमोलिक्युलर र इन्ट्रामोलिक्युलर क्रस-लिंक्ड एडक्टहरू पनि पहिचान गर्यौं।हामीले HLA-A प्रोटीनहरू (H2BFS-HLA-A-HMGA1) को-इम्युनोप्रेसिपिटेशन प्रयोग गरेर र आणविक गतिशीलता मोडेलिङ प्रयोग गरेर तिनीहरूको थप अध्ययनको प्रयोग गरेर बनाइएको इन्टरफेरोन-इन्ड्युसिबल प्रोटीन नेटवर्कहरूको उपन्यास सेटको अर्थोगोनल प्रमाणीकरणमा ध्यान केन्द्रित गर्यौं।प्रोटीन कम्प्लेक्सको संरचनात्मक गतिशीलताको मोडेलिङले धेरै अन्तरक्रिया साइटहरू प्रकट गर्‍यो जसले CLMS निष्कर्षहरूमा पहिचान गरिएका अन्तरक्रियाहरूलाई प्रतिबिम्बित गर्दछ।सँगै, हामी इन्टरफेरोन द्वारा प्रेरित नयाँ सिग्नलिंग कम्प्लेक्सहरू पहिचान गर्न CLMS को एक पायलट अध्ययन प्रस्तुत गर्दछौं, र ट्युमर सूक्ष्म वातावरणमा प्रोटीन अन्तरक्रियाको नयाँ गतिशीलता पहिचान गर्न CLMS को व्यापक प्रयोगको लागि तत्पर छौं।
एक अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया सुरु हुनु अघि, होस्टको जन्मजात प्रतिरक्षा प्रणालीले इन्टरफेरोन्स (IFNs) भनिने स्रावित अल्फा-हेलिकल साइटोकाइनहरूको परिवारद्वारा मध्यस्थतामा एन्टिमाइक्रोबियल प्रतिक्रिया माउन्ट गर्दछ।प्रकार I IFN वर्गहरू IFNα र IFNβ ले सेलुलर प्रतिक्रियाहरू सक्रिय गर्दछ, एन्टिभाइरल, प्रोपोप्टोटिक, प्रोइनफ्लेमेटरी, र एन्टिप्रोलिफेरेटिभ अवस्थाहरू सहित।मानवहरूमा, IFNα को 13 उपप्रकारहरू ज्ञात छन्, सबै क्रोमोजोम 91 मा क्लस्टर गरिएका छन्। अचम्मको कुरा, IFNα2 मात्र क्लिनिकल प्रयोगको लागि अध्ययन गरिएको छ।हालै, IFNα को अन्य उपप्रकारहरूमा अनुसन्धान गर्न विशेष ध्यान दिइएको छ।भर्खरैको अध्ययनले देखाएको छ कि IFNα14 HBV2 र HIV-13,4 प्रतिकृतिलाई प्रतिबन्धित गर्ने सबैभन्दा प्रभावकारी isoforms मध्ये एक हो क्यानोनिकल IFNα2 उपप्रकारको तुलनामा।
यो स्थापित गरिएको छ कि सक्रिय प्रकार I इन्टरफेरोन रिसेप्टर कम्प्लेक्स (IFNAR1 र IFNAR2) ले Janus kinases TYK2 र JAK15,6 द्वारा मध्यस्थता गरिएको सिग्नल ट्रान्सडक्शन क्यास्केड ट्रिगर गर्दछ।यी जेनुस किनेसेस फास्फोरीलेट सिग्नल ट्रान्सड्यूसरहरू र ट्रान्सक्रिप्शनल प्रोटीन एक्टिभेटरहरू (STAT1 र STAT2) टायरोसिन अवशेषहरूमा SH2 डोमेन-मध्यस्थता heterodimerization6 प्रारम्भ गर्न।पछि, IRF9 ले STAT heterodimers लाई IFN-उत्तेजित कारक 3 जीन (ISGF3) को ट्रिमरिक कम्प्लेक्स बनाउनको लागि बाँध्छ, जसले न्यूक्लियसमा स्थानान्तरण गर्दछ र 2000 भन्दा बढी इन्टरफेरोन-उत्तेजित जीन (ISGs) 5,6,7, को ट्रान्सक्रिप्शनलाई प्रेरित गर्दछ।
ISGs जन्मजात प्रतिरक्षा प्रणालीको मेरुदण्ड बनाउँछ, विशेष गरी भाइरल आक्रमणको प्रतिक्रियामा।भाइरल संक्रमण विरुद्ध रक्षा को पहिलो लाइन को रूप मा, कोशिकाहरु को जैविक गतिविधिहरु को एक विस्तृत श्रृंखला संग सेलुलर प्रोटीन को व्यापक अन्तरक्रिया को तेजी से तैनात गर्दछ।यी प्रोटीनहरूमा ढाँचा पहिचान रिसेप्टरहरू, सिग्नलिङ अणुहरू, ट्रान्सक्रिप्शन कारकहरू, र प्रत्यक्ष एन्टिभाइरल कार्यहरू भएका प्रोटीनहरू, साथै प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाहरूको नकारात्मक नियामकहरू समावेश छन्।ISG गतिविधिमा धेरै जानकारी ओभरएक्सप्रेसन स्क्रिनहरू 10,11 वा जीन साइलेन्सिङ प्रविधिहरू (siRNA, RNAi र CRISPR) 12,13 प्रयोग गरी कार्यात्मक स्क्रिनहरूबाट आउँछ जसमा व्यक्तिगत ISG हरू व्यक्त वा निषेध गरिन्छ र तिनीहरूको गतिविधि विभिन्न भाइरसहरूमा परीक्षण गरिन्छ।यद्यपि यी अध्ययनहरूले व्यक्तिगत ISGs को एन्टिभाइरल गुणहरू निर्धारण गरेको छ, प्रत्येक ISG को अन्तर्निहित आणविक संयन्त्रहरू धेरै हदसम्म अज्ञात छन्।यो सामान्यतया स्वीकार गरिएको छ कि धेरै प्रोटीनहरूले पूर्ण गतिविधि सुनिश्चित गर्न एक वा बढी साइटोकाइनहरूसँग अन्तरक्रिया गर्छन्, त्यसैले या त ISG हरू प्रत्यक्ष रूपमा अन्तरक्रिया गर्छन् वा तिनीहरूको अन्तरक्रिया सेलुलर प्रोटीनहरूद्वारा मध्यस्थता गरिन्छ।उदाहरणका लागि, भर्खरको फोटोक्रोसलिङ्क प्रोटिओमिक्स अध्ययनले ATPase VCP/p97 लाई प्रमुख IFITM3 अन्तरक्रिया साझेदारको रूपमा पहिचान गर्‍यो, जसको अवरोधले लाइसोसोमल क्रमबद्ध, कारोबार, र IFITM3 को भाइरल कणहरू 14 को साथमा कोट्रान्सपोर्टमा त्रुटिहरू निम्त्याउँछ।इम्युनोप्रेसिपिटेशन प्रयोग गरेर, हामीले VAPA, एक भेसिकल-सम्बद्ध प्रोटीन, IFITM1/2/3 सँग अन्तरक्रिया साझेदारको रूपमा पहिचान गर्‍यौं जसले कोलेस्ट्रोल-मध्यस्थता भाइरल परिपक्वताको मध्यस्थता गर्दछ, र यो खमीर दुई-हाइब्रिड प्रणाली प्रयोग गरेर अर्को अध्ययनद्वारा पुष्टि भयो।वैज्ञानिक समर्थन 15, 16।
संक्रमण र घातक रूपान्तरणको दमनमा संलग्न एक आधारभूत जैविक प्रक्रिया एन्टिजेन प्रस्तुतीकरण हो, जुन प्रमुख हिस्टोकम्प्याटिबिलिटी कम्प्लेक्स (MHC) अणुहरूद्वारा मध्यस्थता गरिन्छ।पेप्टाइड्स (८-१२ एमिनो एसिड लामो) क्लीभ गरिएको, समय भन्दा पहिले समाप्त वा गलत फोल्ड गरिएको प्रोटिनहरू MHC-I heterodimer मा लोड गरिन्छ (MHC-I भारी र हल्का चेनहरू, जसलाई β-2-microglobulin भनिन्छ; β2M) 17,18।परिणामस्वरूप स्थिर MHC-I ट्रिमरहरू सेल सतहमा सारिन्छन्, जहाँ तिनीहरूले CD8+ T कोशिकाहरू (साइटोटोक्सिक T कोशिकाहरू) 17 मा इन्ट्रासेलुलर पेप्टाइडहरू प्रस्तुत गर्छन्।T कोशिकाहरूले यी रोगजनकहरू र ट्यूमर-विशिष्ट एन्टिजेन बोक्ने कोशिकाहरूलाई चिन्छन् र नष्ट गर्छन्।फलस्वरूप, रोगजनक र ट्युमर कोशिकाहरूले प्रायः प्रतिरक्षा निगरानीबाट बच्न एन्टिजेन प्रस्तुतीकरण प्रक्रियालाई दबाउन्छन्।थप रूपमा, MHC-I मानव ट्यूमरको 40-90% मा डाउनरेगुलेट गरिएको छ र प्रायः एक गरीब प्रोग्नोसिस 19 संग सम्बन्धित छ।
रोगजनकहरूलाई प्रतिक्रिया दिन संलग्न जीनहरू चाँडै आरामको अवस्था र सक्रिय ट्रान्सक्रिप्शनको अवस्था बीच स्विच गर्नुपर्छ।तसर्थ, धेरै सेलुलर प्रोटीनहरू छोटो अवधिमा उच्च IFN मागको प्रतिक्रियामा संलग्न हुने परिकल्पना गरिएको छ, प्रमोटर क्रोमाटिन 20,21 को पुन: निर्माण र परिमार्जन सहित।धेरै अध्ययनहरूले IFN को उपस्थितिमा व्यक्तिगत ISG प्रोटीन साझेदारहरूको पहिचानमा ध्यान केन्द्रित गरेको छ।मोडेल सेल प्रणालीहरूमा धेरै प्रोटोमिक र ट्रान्सक्रिप्टोमिक अध्ययनहरूले सेलुलर परिदृश्यमा IFN को प्रभावलाई स्पष्ट पारेको छ।यद्यपि, इन्टरफेरोनहरूद्वारा प्रेरित गतिशीलताको बढ्दो बुझाइको बावजुद, हामीलाई अझै पनि ISGs को संलग्नताको बारेमा थोरै थाहा छ।इन्टरफेरोन सिग्नलिङको जटिलता र समय-निर्भर गतिशीलतालाई विचार गर्दा, दुई प्रश्नहरू उठ्छन्: (i) द्रुत सिग्नलिङमा संलग्न मल्टिप्रोटिन कम्प्लेक्सहरूलाई स्थिर र जालमा राख्न सम्भव छ, र (ii) के यी अन्तरक्रियाहरू 3D स्पेसमा म्याप गर्न सकिन्छ?
यी मुद्दाहरूलाई सम्बोधन गर्न, हामीले IFNα-प्रेरित प्रोटीन अन्तरक्रिया सञ्जाल र यसको गतिशीलता अध्ययन गर्न मास स्पेक्ट्रोमेट्री (CLMS) सँग मिलाएर disuccinimide suberate-mediated रासायनिक क्रस-लिङ्किङ (DSS) लागू गर्यौं।DSS ले प्रोटिनको प्रोक्सिमल अवशेषहरू र/वा प्रोटिन कम्प्लेक्सहरू बीचको सहसंयोजक बन्डहरू थप्छ।त्यसपछिको MS विश्लेषणले विशिष्ट क्रसलिङ्किङ साइटहरू प्रकट गर्दछ जसले एक विशेष प्रोटीन भित्र क्षेत्रहरूको स्थानिय निकटतालाई प्रतिबिम्बित गर्दछ, जसलाई आन्तरिक सम्बन्ध भनिन्छ, वा प्रोटीन परिसरहरूमा सब्युनिट्स भनिन्छ, जसलाई अन्तरसम्बन्ध भनिन्छ।यो दृष्टिकोण प्रयोग गरेर, हामीले धेरै उपन्यास प्रोटीन-प्रोटिन परिसरहरू साथै इन्टरफेरोन-प्रेरित मल्टिप्रोटिन अन्तरक्रिया सञ्जालहरू पहिचान गरेका छौं।यी नयाँ अन्तरक्रियाहरूको उपसमूहलाई थप परीक्षण गरेर, हामीले H2BFS (H2B हिस्टोन-प्रकार FS; यसपछि H2B भनिन्छ) र MDN1 HLA-A का लागि बाध्यकारी साझेदारहरूको रूपमा कार्य गर्दछ भनेर देखाउँछौं।
Flo-1 कोशिकाहरू esophageal adenocarcinoma को भिट्रो मोडेलहरूमा सबैभन्दा राम्रो चिनिन्छन् किनभने तिनीहरूले esophageal tumors 22,23 को मुख्य विशेषताहरूको नक्कल गर्छन्।यद्यपि, सबै ट्युमरहरू इम्युनोजेनिक हुँदैनन्, र Flo-1 कोशिकाहरूले इन्टरफेरोन उपचारमा प्रतिक्रिया दिन्छन् कि भनेर निर्धारण गर्न, हामीले Flo-1 कोशिकाहरूलाई 10 ng/ml IFNα सँग ७२ घण्टासम्म उपचार गर्यौं।Flo-1 कोशिकाहरूले pSTAT1 र IRF1 को प्रारम्भिक प्रेरण देखाए, उपचार पछि 2 घण्टा सुरु गरी 72 घण्टासम्म जारी रह्यो, IRF1 (चित्र 1A) को स्थिर स्तरहरूमा समय-निर्भर घटेको साथ।ISGs (MX1, IFITM1, OAS1/2, र ISG15) IFNα (चित्र 1A) मा क्लासिक मध्य र ढिलो चरण प्रतिक्रियाहरूको नक्कल गर्दै, 6 घण्टा पछि कडा रूपमा प्रेरित भएको फेला पर्यो।सँगै, यी डेटाले सुझाव दिन्छ कि यो सेलुलर मोडेल इन्टरफेरोन प्रतिक्रियाहरू अध्ययन गर्न प्रयोग गर्न सकिन्छ।
IFNα उपचार पछि Flo-1 कोशिकाहरूमा भिन्न प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रतिक्रियाहरू।(A) 2, 6, 24, 48 र 72 घण्टाको लागि 10 ng/ml IFNα सँग उपचार गरिएको Flo-1 कोषहरूमा प्रोटिन अभिव्यक्ति संकेत गरिएको ISG एन्टिबडीहरू प्रयोग गरेर इम्युनोब्लटद्वारा विश्लेषण गरिएको थियो।(B) संकेतित समय र सांद्रताका लागि DSS सँग क्रस-लिङ्किङ गरेपछि सम्पूर्ण सेल एक्स्ट्र्याक्टको Coomassie नीलो दाग भएको SDS-PAGE जेलहरू।(C) प्रोटिन क्रस-लिङ्किङको डिग्री मूल्याङ्कन गर्न उही नमूनाहरूबाट p53 (DO-1) एन्टिबडीसँग प्रतिनिधि इम्युनोब्लट जाँच गरियो।
इन सिटु प्रोटीन अन्तरक्रिया परिदृश्य क्याप्चर गर्न, हामीले DSS प्रयोग गर्यौं, यसको उच्च झिल्ली पारगम्यता र अपेक्षाकृत छोटो प्रतिक्रिया समयको कारणले व्यापक रूपमा प्रयोग गरिएको क्रस-लिङ्किङ एजेन्ट।छोटो प्रतिक्रिया समयले क्रसलिङ्क गरिएको प्रोटीनहरूको ठूलो समुच्चयको गठनलाई रोक्न मद्दत गर्दछ, जसले गर्दा क्रसलिङ्करको स्थिरता कायम राख्छ।इष्टतम DSS एकाग्रता निर्धारण गर्न र ओभर-क्रसलिङ्किङबाट बच्न, हामीले पहिले सेलहरूलाई 5, 2.5, र 1 mM DSS लाई क्रमशः 5, 10, 5, र 30 मिनेटमा खुलासा गर्यौं, र Coomassie-stained SDS-PAGE द्वारा lysates विश्लेषण गर्यौं। (डेटा देखाइएको छैन)।सेल लाइसेटहरू सबैभन्दा कम एकाग्रतामा र सबैभन्दा छोटो समय बिन्दुमा अत्यधिक क्रस-लिङ्क गरिएको देखिन्छ।तसर्थ, DSS 5 मिनेटमा 1, 0.5, र 0.1 mM मा टाइटर गरिएको थियो (चित्र 1B)।इष्टतम क्रसलिङ्किङ 0.5 mM DSS सँग 5 मिनेटको लागि अवलोकन गरिएको थियो, र यी सर्तहरू IFNα सँग उपचार गरिएका कक्षहरूको लागि छनोट गरिएको थियो।थप रूपमा, चित्र 1C ले प्रोटीन क्रस-लिङ्किङको डिग्री मूल्याङ्कन गर्न p53 (DO-1) एन्टिबडी प्रयोग गरी प्रदर्शन गरिएको पश्चिमी ब्लट देखाउँछ।
Flo-1 कोशिकाहरूलाई क्रसलिङ्कर थप्नु अघि 24 घण्टाको लागि 10 ng/ml IFNα सँग उपचार गरियो।क्रस-लिंक गरिएका कोशिकाहरूलाई पछि दुई-चरण प्रोटियोलिसिसद्वारा लिइयो र प्रोटीनहरू FASP (चित्र 2) 24,25 द्वारा प्रशोधन गरियो।क्रस-लिंक गरिएको ट्रिप्टिक पेप्टाइडहरू मास स्पेक्ट्रोमेट्री (चित्र 2) द्वारा विश्लेषण गरिएको थियो।MS/MS स्पेक्ट्रालाई प्रोटिन अनुक्रमसँग मिलाइन्छ र MaxQuant26,27 सँग मापन गरिन्छ।क्रस-लिङ्क गरिएको पेप्टाइडहरू SIM-XL कार्यक्रम प्रयोग गरेर प्राप्त स्पेक्ट्राबाट पहिचान गरिएको थियो, र व्यक्तिगत यौगिकहरूलाई xQuest28 र SIM-XL29 खुला स्रोत कम्प्युटिङ सफ्टवेयर पाइपलाइनहरू (चित्र 2) प्रयोग गरेर जटिल नेटवर्कमा जोडिएको थियो।SIM-XL ले प्रोटीन-प्रोटिन अन्तरक्रियाहरू, आन्तरिक चेनहरू र व्यक्तिगत चेनहरूलाई सरल वा जटिल प्रोटीन मिश्रणहरूमा पहिचान गर्दछ र प्रोटीन संरचनाहरूमा अन्तरक्रियाहरू दृश्यावलोकन गर्न लिपिहरू प्रदान गर्दछ।थप रूपमा, यसले प्रत्येक क्रस-सन्दर्भलाई MS/MS29 स्पेक्ट्रम गुणस्तर अनुसार आईडी स्कोरको रूपमा श्रेणीबद्ध गर्दछ।धेरै उच्च भरपर्दो प्रोटीन-प्रोटिन अन्तरक्रिया र कम्प्लेक्सहरू पहिचान गरिएको छ, र अन्तरक्रियाहरूको नयाँ सेट को-इम्युनोप्रेसिपिटेशन र आणविक गतिशीलता (MD) मोडेलिङ (चित्र 2) 30, 31 प्रयोग गरेर जटिलहरूको संरचनात्मक परिवर्तनहरू प्रयोग गरेर थप अनुसन्धान गरिएको छ।
CLMS विधिको योजनाबद्ध सिंहावलोकन।Flo-1 कोशिकाहरूलाई 10 ng/ml IFNα सँग 24 घण्टाको लागि उपचार गरियो, त्यसपछि DSS प्रयोग गरेर सिटु प्रोटीन क्रस-लिङ्किङ पछि सेल लाइसिस र ट्रिप्सिनाइजेशन।अर्बिट्राप मास स्पेक्ट्रोमिटर प्रयोग गरेर क्रस-लिङ्क गरिएका नमूनाहरू विश्लेषण गरियो र LC-MS/MS को समयमा पेप्टाइड पूर्ववर्तीहरूको खण्डीकरणको लागि थप नमूना गरियो।क्रसलिङ्क्ड पेप्टाइड्स (SIM-XL) कार्यक्रमको स्पेक्ट्रम पहिचान मेसिन प्रयोग गरेर प्राप्त स्पेक्ट्राबाट दुई लिङ्क गरिएको पेप्टाइडहरू पहिचान गरियो, र सबै कम्पाउन्डहरू कम्प्युटेसनल पाइपलाइनहरू प्रयोग गरेर जटिल नेटवर्कमा जोडिएका थिए।गलत सकारात्मक दर (FDR) स्कोरहरूमा आधारित कम आत्मविश्वास अन्तरक्रियाहरू फिल्टर गर्नुहोस्।धेरै नयाँ उच्च फिडेलिटी प्रोटीन-प्रोटिन अन्तरक्रियाहरू सह-इम्युनोप्रेसिपिटेशन प्रयोग गरेर थप पुष्टि गरियो, र कम्प्लेक्सहरूमा संरचनात्मक परिवर्तनहरू आणविक गतिशीलता (MD) मोडलिङ प्रयोग गरेर जाँच गरियो।
कुल ~30,500 र ~28,500 पेप्टाइडहरू क्रमशः अनस्टिमुलेटेड र उत्तेजित IFNα नमूनाहरूमा MaxQuant प्रयोग गरी पत्ता लगाइयो (पूरक तालिका S1, चित्र 3A)।दुबै केसहरूमा पेप्टाइड लम्बाइ वितरणले ठूला पेप्टाइडहरूको उच्च अनुपात देखायो, क्रस-लिंक गरिएको पेप्टाइड्स (चित्र 3B, C) को उपस्थितिलाई संकेत गर्दछ।थप रूपमा, IFNα-उपचार गरिएका नमूनाहरू (चित्र 3C) मा 40-55 दायरामा ठूला पेप्टाइडहरूको ठूलो अनुपात उपस्थित थियो।log2 तीव्रता विरुद्ध प्रोटिन म्यापिङले देखायो कि क्लासिक इन्टरफेरोन-उत्तेजित प्रोटीनहरू उपचार नगरिएका नमूनाहरूको तुलनामा सबैभन्दा प्रचुर मात्रामा थिए, MX1, IFIT1/3, OAS2/3, DDX58, र HLA-F (चित्र 3D) सहित।Reactome पाथवे डाटाबेस प्रयोग गरेर IFNα उपचारको प्रतिक्रियामा तीन गुणा भन्दा बढी प्रोटीनहरूको लागि मार्गहरूको विश्लेषणले MHC-I-मध्यस्थता एन्टिजेन प्रस्तुतीकरण र प्रशोधन सबैभन्दा प्रभावशाली मार्ग थियो (चित्र 3E) देखाएको छ।पहिलेका रिपोर्टहरूसँग अनुरूप, OAS र ISG15 द्वारा मध्यस्थता गरिएको एन्टिभाइरल प्रतिक्रियाहरू साथै IFNα/β र साइटोकाइन संकेतहरू सक्रिय गरिएका मार्गहरूमध्ये थिए।थप रूपमा, लाइसिन- र सेरीन-विशिष्ट प्रोटीन क्रस-लिङ्कहरू सिम-एक्सएल प्रयोग गरेर मूल रूपमा अधिग्रहण गरिएको MS/MS स्पेक्ट्राबाट पहिचान गरियो।भर्खरैको अध्ययनले 5 सेल प्रकारमा व्यक्तिगत ISG ओभरएक्सप्रेसन अध्ययनहरूको मेटा-विश्लेषणद्वारा 9 भाइरस वर्गहरूबाट 20 भाइरसहरू फैलाउने 104 ISGs रिपोर्ट गरेको छ।जे होस्, ठूला डाटासेटहरू स्क्रिनिङ गर्ने कम्प्युटेशनल सीमितताहरू पार गर्न, हामीले पाडारिया एट अल द्वारा रिपोर्ट गरिएको IRDS जीनहरूको सूची बीचको सम्भावित अन्तरक्रियाहरू अन्वेषण गर्न एउटा सानो डाटासेटको साथ सुरु गर्यौं, जसमध्ये अधिकांश ISG हरू हुन्।
IFNα (MaxQuant बाट प्राप्त डाटा) को प्रतिक्रियामा भिन्न रूपमा व्यक्त गरिएको क्रस-लिङ्क प्रोटीनहरूको पहिचान।(A) IFNα14 उपचार गरिएका र उपचार नगरिएका Flo-1 नमूनाहरूमा पहिचान गरिएका साधारण र अनन्य पेप्टाइडहरूको सङ्ख्या प्रतिनिधित्व गर्ने भेन रेखाचित्र।उपचार नगरिएको (B) र IFNα उपचारित (C) क्रसलिङ्क गरिएको नमूनाहरूको पेप्टाइड लम्बाइ वितरण।(D) उपचार नगरिएको र IFNα14 उपचार गरिएका Flo-1 कोशिकाहरू बीच लग2 (LFQ तीव्रता) को प्रतिनिधित्व गर्ने ताप नक्सा।बायाँ प्यानलले IFNα को उपस्थितिमा सबैभन्दा सक्रिय रूपमा सक्रिय प्रोटीनहरू देखाउँछ।(E) IFNα उपचार पछि 20 प्रमुख संवर्धन मार्गहरू प्रतिनिधित्व गर्ने हिस्टोग्राम।Reactome मार्ग डाटाबेसले अपरेगुलेट IFNα-उत्तरदायी प्रोटीनहरूमा चार-गुना भन्दा बढी परिवर्तनहरू विश्लेषण गर्यो।
इन्टरफेरोन-मध्यस्थता ISG उत्तेजना राम्रोसँग दस्तावेज गरिएको छ, तर आणविक स्तरमा यी प्रोटीनहरू जैविक प्रकार्यहरूको विस्तृत दायरामा कसरी परिणत हुन्छन् भन्ने कुरा राम्रोसँग बुझिएको छैन।हामीले ज्ञात ISG हरू बीच उच्च स्तरको विश्वासको साथ प्रोटीन अन्तरक्रियाहरूको अनुसन्धान गर्यौं।चाखलाग्दो कुरा के छ भने, हामीले MX1, USP18, ROBO1, OAS3, र STAT1 प्रोटीनहरू सहित नेटवर्क पहिचान गर्यौं जसले IFNα उपचार (चित्र 4, तालिका S2) 32,33,34 को प्रतिक्रियामा ठूलो जटिल बनाउँछ।सबैभन्दा महत्त्वपूर्ण कुरा, यी अन्तरक्रियाहरू IFNα सँग उपचार गरिएका सबै ट्रिप्लिकेटहरूमा फेला परेका थिए र उपचार नगरिएका नमूनाहरूमा फेला परेनन्, सुझाव दिन्छ कि तिनीहरू विशेष रूपमा IFNα उपचारको प्रतिक्रियामा गठन गरिएका थिए।यो ज्ञात छ कि STAT1 ट्रान्सक्रिप्शनली यी ISGs को अभिव्यक्ति विनियमित गर्दछ, तर प्रोटीन स्तर मा ISGs संग यसको अन्तरक्रिया को अध्ययन गरिएको छैन।STAT1 को क्रिस्टल संरचनाले देखायो कि यसको हेलिकल डोमेन (CCD) dimers35 को गठनको क्रममा DNA वा प्रोटोमरहरूसँग अन्तरक्रियामा संलग्न छैन।यी α-helices ले एक हेलिकल हेलिक्स संरचना बनाउँछ जसले अन्तरक्रियाहरू हुनको लागि मुख्य रूपमा हाइड्रोफिलिक सतह क्षेत्र प्रदान गर्दछ 35।हाम्रो CLMS डेटामा, हामीले अवलोकन गर्यौं कि STAT1 सँग धेरै अन्तरक्रियाहरू SH2 डोमेनमा CCD, लिङ्कर डोमेन, वा C-टर्मिनल टेल (अवशेषहरू 700-708) (चित्र 4A) अघि भएको थियो।अघिल्लो अध्ययनले रिपोर्ट गरेको छ कि USP18 STAT2 को CCD र DNA-बाइन्डिङ डोमेन (DBD) मा बाँधिएको छ र टाइप I इन्टरफेरोन रिसेप्टर IFNAR2 को सबयुनिटमा भर्ती गरिएको छ टाइप I इन्टरफेरोन सिग्नलिंग 24 को अवरोध मध्यस्थता गर्न।हाम्रो डेटाले USP18 उत्प्रेरक डोमेनले STAT1 DBD (चित्र 4A,D) सँग अन्तर्क्रिया गर्दछ, STAT1 र STAT2 दुवैले USP18 लाई IFNAR2 मा आकर्षित गर्न भूमिका खेल्न सक्छ भनी सुझाव दिन्छ।
प्रोटिन-प्रोटिन ISG नेटवर्क IFNα सँग उपचार गरिएको क्रस-लिङ्क गरिएको कोशिकाहरूमा पहिचान गरियो।(A) 2D अन्तर्क्रिया प्लट प्रोटीन-प्रोटिन अन्तरक्रियाहरू देखाउँदै (SIM-XL कार्यक्रममा उत्पन्न), इन्टरमोलिक्युलर अन्तरक्रियाहरू प्रतिनिधित्व गर्ने रेखाहरूसँग (3.5 मा क्रसलिङ्क कटअफ सेट)।विभिन्न पहिचानका डोमेनहरू तिनीहरूको रङ ३२: MX1 डोमेन, Dynamin_N (73-249), Dynamin_M (259-547), र GED (569-660) द्वारा चिन्ह लगाइन्छ।OAS3 डोमेनहरू: OAS1_C (160-344), OAS1_C (559-745), NTP_transf_2 (780-872), र OAS1_C (903-108)।डोमेन ROBO1, Ig_3 (67-151), I-set (170-258), I-set (262-347), Ig_3 (350-432), Ig_3 (454-529), fn3 (562-646), fn3 (६७८–७५८) र fn3 (७७७–८६४)।STAT1 क्षेत्रहरू: STAT_int (2–120), STAT_alpha (143–309), STAT_bind (321–458), SH2 (573–657), र STAT1_TAZ2bind (715–739)।(B) क्रस-लिङ्क गरिएका प्रोटीनहरू (MX1, UBP18, OAS3, ROBO1, र STAT1) को सर्कुलर दर्शक क्रमशः नीलो र रातोमा लेबल गरिएको अन्तरक्रिया र अन्तरक्रियाहरू।क्रस-लिङ्क थ्रेसहोल्ड 3.5 मा सेट गरिएको थियो।डट प्लटहरूले STAT1 अन्तरक्रिया साइटहरू MX1 (C), USP18 (D), ROBO1 (E), र OAS3 (F), साथै दुई पेप्टाइडहरू बीच K वा S अन्तरक्रिया साइटहरू संकेत गर्दछ।चित्रमा, क्रस-लिङ्क स्कोर थ्रेसहोल्ड 3.0 मा सेट गरिएको छ।(G) STAT1 र OAS3 DI डोमेनहरू बीचको विभिन्न अन्तरक्रिया साइटहरू PyMol (PyMOL आणविक ग्राफिक्स प्रणाली, संस्करण 2.0 Schrödinger, LLC) मा तिनीहरूको प्रोटीन संरचनाहरूमा सुपरइम्पोज गरिएको;STAT1 (pdb id: 1bf533) र OAS3 (pdb id: 4s3n34)।) कार्यक्रम।
USP18 को दुई आइसोफर्महरू मानिसहरूमा वर्णन गरिएको छ, एक पूर्ण-लम्बाइको प्रोटीन जुन मुख्यतया न्यूक्लियसमा अवस्थित हुन्छ, र N-टर्मिनल डोमेन बिनाको आइसोफर्म, USP18-sf, जुन साइटोप्लाज्म र न्यूक्लियस 36 मा समान रूपमा वितरित हुन्छ।थप रूपमा, N-टर्मिनस असंरचित हुने भविष्यवाणी गरिएको थियो र यसलाई isopeptidase गतिविधि वा ISG1537 बाध्यकारी आवश्यक पर्दैन।हाम्रो अध्ययनमा पहिचान गरिएका अधिकांश अन्तरक्रियाहरू प्रोटीनको एन-टर्मिनसमा अवस्थित थिए, सुझाव दिन्छ कि यी अन्तरक्रियाहरूमा पूर्ण-लम्बाइ USP18 (चित्र 4A, D) समावेश छ र यसैले सम्भवतः न्यूक्लियसमा हुन्छ।यसबाहेक, हाम्रो डेटाले यो पनि संकेत गर्दछ कि एन-टर्मिनस प्रोटीन-देखि-प्रोटिन अन्तरक्रियाको लागि विशेष छ।IFNAR2 बाइन्डिङ साइट अवशेषहरू 312-368 बीचमा अवस्थित छ, र विशेष गरी, यस क्षेत्र (चित्र 4A) 37,38 मा कम्प्लेक्समा कुनै पनि प्रोटिनहरू बाँध्दैनन्।यी डेटा सँगै लिइएको संकेत गर्दछ कि IFNAR2 बाध्यकारी डोमेन विशेष रूपमा रिसेप्टर प्रोटीन द्वारा प्रयोग गरिन्छ।थप रूपमा, केवल OAS3 र ROBO1 N-टर्मिनस र IFNAR2 बाइन्डिङ साइट (चित्र 4A) को अपस्ट्रीम डोमेनहरूसँग सम्बन्धित भएको फेला पर्यो।
ROBO1 ट्रान्समेम्ब्रेन सिग्नलिङ अणुहरूको इम्युनोग्लोबुलिन (Ig) सुपरफैमिलीसँग सम्बन्धित छ र यसले बाह्य कोशिका क्षेत्रमा पाँच Ig डोमेन र तीन फाइब्रोनेक्टिन (Fn) डोमेनहरू समावेश गर्दछ।यी एक्स्ट्रासेल्युलर डोमेनहरू झिल्ली-प्रोक्सिमल क्षेत्र र एकल ट्रान्समेम्ब्रेन हेलिक्स 39 द्वारा पछ्याइएको छ। एक असंरचित इन्टरसेलुलर क्षेत्र C-टर्मिनसमा अवस्थित छ र यसले प्रभावकारी प्रोटीन बाइन्डिङको मध्यस्थता गर्ने संरक्षित अनुक्रम मोटिफहरू समावेश गर्दछ।एमिनो एसिड ~1100 देखि 1600 सम्म फैलिएको क्षेत्र प्रायः अव्यवस्थित छ।हामीले पत्ता लगायौं कि MX1 ले ROBO1 सँग Ig, Fn, र intracellular डोमेनहरू मार्फत अन्तरक्रिया गर्दछ, जबकि STAT1 सँग धेरै अन्तरक्रियाहरू यसको CCD, लिङ्कर डोमेन, र ROBO1 (चित्र 4A,E) को C-टर्मिनस बीचमा हुन्छन्।अर्कोतर्फ, DI, DIII, र OAS3 लिङ्कर क्षेत्रहरूसँग अन्तरक्रियाहरू ROBO1 प्रोटीन (चित्र 4A) मा वितरित गरियो।
oligoadenylate synthase (OAS) प्रोटीन परिवारले intracellular double-stranded RNA (dsRNA) लाई स्वीकार गर्दछ र बाँध्छ, संरचनात्मक परिवर्तनहरू पार गर्दछ, र 2′,5′-लिंक्ड oligoadenylates (2-5 As) 40 को संश्लेषण गर्दछ।यो फेला पर्यो कि तीन OAS हरू मध्ये, OAS3 ले dsRNA को लागि उच्चतम आत्मीयता प्रदर्शन गर्दछ र कम्तिमा 2-5 As को संश्लेषण गर्दछ, जसले RNase L सक्रिय गर्न सक्छ र यसरी भाइरल प्रतिकृति 41 लाई सीमित गर्दछ।OAS परिवारमा पोलिमरेज बिटा (pol-β) जस्तै न्यूक्लियोटाइड ट्रान्सफरेज डोमेनहरू हुन्छन्।अघिल्लो अनुसन्धानले देखाएको छ कि C-टर्मिनल डोमेन (DIII) को उत्प्रेरक गतिविधि dsRNA-बाइंडिंग डोमेन (DI) मा निर्भर छ, जुन OAS342 को सक्रियताको लागि आवश्यक छ।हामीले OAS3 को DI र DII डोमेनहरूले CCD र SH2 र STAT1 TAD (चित्र 4A, F) बीचको सानो जंक्शन क्षेत्रसँग अन्तरक्रिया गरेको देख्यौं।प्रोटिन संरचनामा विभिन्न क्रसलिङ्किङ साइटहरू ओभरले गर्दा β-शीट र DBD STAT1 लुप र OAS3 (चित्र 4G) को DI डोमेनमा अवशेषहरू 60-75 द्वारा बनेको खुला पकेट वा गुहा बीचको अन्तरक्रिया प्रकट भयो।कम्प्लेक्समा रहेका प्रोटिनहरूको अभिमुखीकरणले OAS3 सँगको कुनै पनि अन्तरक्रियाले यसको DI डोमेन (चित्र S1A) को DNA-बाइन्डिङ क्षमतामा हस्तक्षेप गरेको छैन भनी संकेत गरेको छ।थप रूपमा, GTPase MX1 को N-टर्मिनल डोमेनले OAS3 (चित्र 4A) को DI र DIII डोमेनहरूसँग व्यापक रूपमा अन्तरक्रिया गर्दछ।हामीले OAS1 र MX1 बीचको अन्तर्क्रियालाई सबै तीन IFNα-उपचार दोहोरिनेहरूमा पनि अवलोकन गर्यौं, जहाँ एकल OAS1 डोमेन (उत्प्रेरक रूपमा सक्रिय) सबै तीन MX1 डोमेनहरू (चित्र S2A, B) सँग अन्तरक्रिया गर्‍यो।
MX प्रोटीनहरू डाइनेइन-जस्तै GTPases को ठूलो परिवारको भाग हो जसमा N-टर्मिनल GTPase डोमेन हुन्छ जसले GTP लाई बाँध्छ र हाइड्रोलाइज गर्छ, एक मध्यवर्ती डोमेन जसले आत्म-विधानसभाको मध्यस्थता गर्दछ, र C-टर्मिनल ल्यूसिन जिपर जसले GTPase (LZ) को रूपमा कार्य गर्दछ। )।डोमेन प्रभावकर्ता डोमेन 25,43।MX1 भाइरल gene43 को ट्रान्सक्रिप्शन ब्लक गर्न भाइरल पोलिमेरासेसको सबयुनिटहरूमा बाँध्छ।पहिले रिपोर्ट गरिएको खमीर दुई-हाइब्रिड स्क्रिनले देखायो कि PIAS1-सम्बद्ध MX1 ले STAT1-मध्यस्थता जीन सक्रियतालाई DNA-बाध्यकारी गतिविधि रोकेर रोक्छ र SUMO E344,45 ligase गतिविधि पनि छ।यहाँ, हामी MX1 STAT1 (चित्र 4C,D) मा बाँधिएको देखाउँछौं, यद्यपि यो अन्तरक्रियाले IFNα को प्रतिक्रियामा STAT1-मध्यस्थता जीन सक्रियतालाई कसरी असर गर्छ थप अध्ययनको आवश्यकता छ।थप रूपमा, हामीले यो पनि फेला पार्‍यौं कि MX1 ले IFIT3 र DDX60 सँग तीनवटै IFNα-उपचार गरिएको दोहोरिने (चित्र S2C) मा अन्तरक्रिया गरेको छ।
DDX60 एक IFN-प्रेरित साइटोप्लाज्मिक हेलिकेस हो जुन पहिले भाइरल RNA46 को RIG-I-स्वतन्त्र गिरावटमा भूमिका खेलेको रिपोर्ट गरिएको छ।यसले RIG-I सँग अन्तरक्रिया गर्छ र यसको संकेतलाई ligand-विशिष्ट तरिकाले सक्रिय गर्दछ 46. DDX60 मा DEXD/H-Box हेलिकेस डोमेन र C-टर्मिनल हेलिकेस डोमेन हुन्छ जसले भाइरल RNA र DNA47 लाई बाँध्छ।MX1 र IFIT3 सँग यसका धेरैजसो अन्तरक्रियाहरू लामो N- र C-टर्मिनल क्षेत्रहरूमा क्यानोनिकल डोमेन वा मोटिफहरू (चित्र S2E,F) बिना नै हुन्छन्।यद्यपि, MX1 पनि DEXD/H-Box हेलिकेस डोमेन (Fig. S2E) सँग सम्बन्धित छ।IFIT परिवारका प्रोटिनहरूमा टेट्रापेप्टाइड रिपीट (TPR) भनिने विशिष्ट हेलिक्स-टर्न-हेलिक्स मोटिफको टेन्डम प्रतिलिपिहरू छन्।IFIT3 RIG-I सिग्नलिङको सकारात्मक मोड्युलेटर भएको फेला पर्यो र यसैले MAVS जटिलको एक घटक।सँगै लिइएको, हाम्रो डेटाले सुझाव दिन्छ कि IFIT3 र DDX60 ले मुख्य रूपमा IFIT3 को TPR 3-6 बीचको क्षेत्रमा अन्तरक्रिया गर्दछ र RIG-I/MAVS सिग्नलिङ (चित्र S2F) मा भूमिका खेल्न सक्छ।
सम्पूर्ण प्रोटोमको स्क्रिनिङ कम्प्युटेशनली गहन छ भन्ने कुरालाई ध्यानमा राख्दै, हामीले IFNα-उपचार दोहोरिने मध्ये एकको उपस्थितिको लागि सम्पूर्ण मानव UniProt डाटाबेसलाई स्क्रिन गर्यौं।यस प्रतिकृतिमा, हामीले HLA-A को लागि धेरै उच्च भरपर्दो अन्तरक्रिया सञ्जालहरू फेला पार्‍यौं।MS/MS स्पेक्ट्रा द्वारा पहिचान गरिएको प्रोटीन मार्गहरूको विश्लेषणले MHC-I-आधारित एन्टिजेन प्रशोधन र प्रस्तुतीकरण इन्टरफेरोन (चित्र 3D) द्वारा प्रेरित मुख्य मार्ग हो भनेर देखाएको छ।तसर्थ, हामीले MHC-I अणुहरूको प्रोटीन अन्तरक्रियाहरू अध्ययन गर्नमा ध्यान केन्द्रित गर्यौं जुन सबै क्रस-लिङ्क गरिएका नमूनाहरूमा उच्च स्तरको विश्वासको साथ।HLA मा α1, α2 र α3 डोमेनहरू र लाइट चेनहरू हुन्छन्, र माइक्रोग्लोबुलिन β2 (β2m) एक स्थिर चेपेरोन प्रोटीन हो।एक पटक एन्डोप्लाज्मिक रेटिकुलममा जम्मा भएपछि, पेप्टाइड लिगान्ड्स 50 को अनुपस्थितिमा एचएलए अस्थिर हुन्छ।पेप्टाइड-बाइन्डिङ ग्रूभ अत्यधिक बहुरूपी र असंरचित α1 र α2 डोमेनहरू गैर-पेप्टाइड फारममा र अपेक्षाकृत कम पोलिमोर्फिक α351 डोमेनद्वारा बनाइन्छ।IFNα को उपस्थितिमा, हामीले दुई HLA-A कम्प्लेक्सहरू पत्ता लगायौं: एउटाले HMGA1 र H2B (चित्र 5, तालिका S3) सँग अन्तरक्रिया गर्छ र अर्कोले MDN1, LRCH4 र H2B (चित्र 6) सँग अन्तरक्रिया गर्छ।
IFNα ले H2B (H2BFS) र HMGA1 सँग HLA-A अन्तरक्रिया सञ्जाललाई प्रेरित गर्छ।(A) 2D प्लट (SIM-XL सफ्टवेयरमा उत्पन्न) H2B-HLA-A-HMGA1 कम्प्लेक्समा विभिन्न प्रकारका अन्तरक्रियाहरू चित्रण गर्दै: इन्टरलिङ्क (नीलो), इन्टरलिङ्क (रातो) र एकल लिङ्क (कालो)।।विभिन्न पहिचानका डोमेनहरू रङ कोडेड ३२: H2B (हिस्टोन; 2-102) र MHC-I (MHC_1; 25-203, समूह C1; 210-290 र MHC_I_C; 337-364) हुन्।क्रस-लिङ्क थ्रेसहोल्ड 3.5 मा सेट गरिएको थियो।डट प्लटहरूले H2B (B) र HMGA1 (C) सँग HLA-A अन्तरक्रिया साइटहरू, साथै दुई पेप्टाइडहरू बीच K वा S अन्तरक्रिया साइटहरू संकेत गर्दछ।चित्रमा, क्रस-लिङ्क स्कोर थ्रेसहोल्ड 3.0 मा सेट गरिएको छ।(D) PyMOL कार्यक्रममा H2B, HLA-A, र HMGA1 प्रोटीनहरूको संरचनाहरूमा देखाइएको प्रोटीनहरू बीचको सम्बन्ध।यी संरचनाहरू Phyre2 सर्भर (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) प्रयोग गरेर मोडेल गरिएको थियो र H2B, HLA-A र HMGA1 प्रोटीनहरूको लागि टेम्प्लेट संरचनाहरू क्रमशः 1kx552, 1kj349 र 2eze55 थिए।
IFNα ले H2B (H2BFS), MDN1 र LRCH4 सँग HLA-A अन्तरक्रिया सञ्जाललाई प्रेरित गर्छ।(A) Intramolecular (रातो) र intermolecular (नीलो) क्रसलिङ्कहरू 2D अन्तरक्रियात्मक नक्सा (SIM-XL सफ्टवेयरमा उत्पन्न) मा MDN1 को रूपमा प्रस्तुत गरिएको छ।क्रस-लिङ्क थ्रेसहोल्ड 3.5 मा सेट गरिएको थियो।विभिन्न पहिचानका डोमेनहरू रङ कोडेड ३२: H2B (हिस्टोन; 2-102), MHC-I (MHC_1; 25-203, समूह C1; 210-290 र MHC_I_C; 337-364) र LRCH4 (LRR_8 (68-126), LRR_8 (137-194) र CH (535-641))।(B) PyMOL कार्यक्रममा H2B, HLA-A, LRCH4, र MDN1 प्रोटीनहरूको संरचनाहरूमा देखाइएको प्रोटीनहरू बीचको सम्बन्ध।यी संरचनाहरूलाई Phyre2 सर्भर (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) प्रयोग गरी मोडल गरिएको थियो जसमा टेम्प्लेट संरचनाहरू 1kx552, 1kj349, 6hlu62 र 6i2665 H2B, HLA-A, LRCH4 र MDN1 प्रोटिनहरू, क्रमशः।H2B (C), LRCH4 (D), र MDN1 (E) सँग HLA-A को लागि K वा S अन्तरक्रिया साइटहरू देखाउने डट प्लटहरू।प्लटहरूको लागि, क्रस-लिङ्क स्कोर थ्रेसहोल्ड 3.0 मा सेट गरिएको थियो।
जीनोमको अखण्डता कायम राख्नुको अतिरिक्त, हिस्टोन H2B ट्रान्सक्रिप्शनको नियमनमा पनि संलग्न छ।H2B प्रोटीनमा केन्द्रीय हिस्टोन डोमेन (HFD) लूपहरू र C-टर्मिनल टेल 41,52 द्वारा विभाजित तीन α-helices द्वारा गठन हुन्छ।H2B सँगको धेरैजसो अन्तरक्रिया α1 हेलिक्समा हुन्छ, जसले HFD हेटेरोडाइमर (चित्र 5A,B) को साथ ट्रिमराइजेशन प्रदान गर्दछ।यद्यपि लाइसिनहरू डीएनए बाइन्डिङमा संलग्न छन्, केही लिसिनहरू वैकल्पिक एसिटिलेशन वा मेथिलेसन साइटहरू पनि हुन्।उदाहरणका लागि, H2B बाट अवशेषहरू K43, K46, र K57 प्रत्यक्ष DNA बाइन्डिङमा संलग्न छैनन्, तर विभिन्न पोस्ट-ट्रान्सक्रिप्शनल परिमार्जनहरूको लक्ष्य हुन्।त्यसैगरी, H2B मा K44, K47, र K57 अवशेषहरूले IFNα को उपस्थितिमा वैकल्पिक भूमिका खेल्न सक्छ, अन्य प्रोटीनहरूसँग अन्तरक्रिया सहित (चित्र 5A, B)।थप रूपमा, एक्स्ट्राक्रोमोसोमल हिस्टोन H2B ले संक्रामक एजेन्टहरू वा क्षतिग्रस्त कोशिकाहरूबाट व्युत्पन्न डबल-स्ट्र्यान्ड डीएनए (dsDNA) टुक्राहरू पत्ता लगाउन साइटोसोलिक सेन्सरको रूपमा कार्य गर्दै विभिन्न सेल प्रकारहरूमा प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया सक्रिय गर्दछ।DNA भाइरसहरूको उपस्थितिमा, H2B कमीले IFN-β उत्पादन र STAT154 फास्फोरिलेसनलाई रोक्यो।H2B लाई अन्य कोर हिस्टोन भन्दा छिटो न्यूक्लियस भित्र र बाहिर जान पनि जानिन्छ54।MDN1 र LRCH4 सँग H2B अन्तरक्रियाहरू चयन गरिएका उपचार नगरिएका नमूनाहरूमा पनि अवलोकन गरियो।हामीले HLA-A ले सबै तीन IFNα-उपचार गरिएका नमूनाहरूमा र एउटा उपचार नगरिएको दोहोरिने नमूनाहरूमा H2B सँग अन्तरक्रिया गरेको फेला पारेको छ।यी डेटाले ट्रान्सक्रिप्शनल नियमनबाट स्वतन्त्र वैकल्पिक शारीरिक कार्यमा H2B को भूमिका प्रतिबिम्बित गर्दछ।
HMGA1 (उच्च गतिशीलता समूह AT-Hook 1), एक सानो न्यूक्लियोप्रोटिन, रोग-प्रवर्द्धन गर्ने एमिनो एसिडमा धनी, HLA-A सँगको सम्बन्धमा पहिचान गरिएको छ।यसमा अम्लीय सी-टर्मिनल पुच्छर र एटी हुक भनिने तीनवटा फरक DBD ​​हरू छन् किनभने तिनीहरू dsDNA55,56 मा AT-धनी क्षेत्रको सानो नालीमा बाँध्छन्।यो बाइन्डिङले DNA लाई झुकाउन वा सीधा बनाउँछ, क्यानोनिकल ट्रान्सक्रिप्शन कारकहरूलाई यसको सहमति अनुक्रम पहुँच गर्न अनुमति दिन्छ।सी-टर्मिनल पुच्छर प्रोटीन-प्रोटिन अन्तरक्रिया र ट्रान्सक्रिप्शन कारकहरूको भर्तीमा संलग्न रहेको विश्वास गरिन्छ, किनकि सी-टर्मिनल मेटाउने म्युटेन्टहरू ट्रान्सक्रिप्शन प्रारम्भ गर्न असमर्थ छन्।यसबाहेक, यस डोमेनले धेरै संरक्षित फास्फोरिलेसन साइटहरू समावेश गर्दछ जुन किनासेस 58 को लागि ज्ञात सब्सट्रेटहरू छन्।हामीले C-टर्मिनल डोमेन बाहिर HMGA1 सँग HLA-A र H2B अन्तरक्रियाहरू अवलोकन गर्यौं, C-टर्मिनल डोमेन मुख्य रूपमा ट्रान्सक्रिप्शन कारक बाइन्डिङका लागि प्रयोग गरिन्छ (चित्र 5A, C)।एचएमजीए प्रोटिनहरूले एडेप्टर डीएनएमा बन्धनका लागि हिस्टोन H1 सँग प्रतिस्पर्धा गर्छन्, जसले गर्दा पहुँच बढ्छ57।त्यसै गरी, यस्तो देखिन्छ कि HMGA ले हिस्टोन H2B सँग हिस्टोन H1 सँग प्रतिस्पर्धामा लिङ्कर DNA सँग अन्तरक्रिया गर्दछ।HMGB1 ले डेन्ड्रिटिक कोशिकाहरूमा HLA-A, -B, र -C को अभिव्यक्तिलाई प्रेरित गर्दछ, जसले तिनीहरूको सक्रियता 59 निम्त्याउँछ, तर HMG र HLA बीचको अन्तरक्रिया पहिले रिपोर्ट गरिएको छैन।हामीले फेला पार्‍यौं कि HMGA1 ले HLA-A को α1 र α3 डोमेनहरूसँग अन्तर्क्रिया गर्दछ, यसको 3 DBD (चित्र 5A, C) भन्दा बाहिरका अधिकांश अन्तरक्रियाहरूसँग।हाम्रो हातमा, HLA-A न्यूक्लियसमा स्थानीयकरण भएको फेला पर्यो (डेटा देखाइएको छैन), र H2B र HMGA1 पनि न्यूक्लियसमा अवस्थित छन्, यो अन्तरक्रिया सम्भवतः न्यूक्लियसमा हुन्छ।H2B, HLA-A, र HMGA1 को बीच मापन गरिएका विशिष्ट एडक्टहरू चित्र 5D मा देखाइएको छ।
अन्य प्रोटीनहरूसँग HLA-A को धेरै अन्तरक्रियाहरू यसको α1 र α2 डोमेनहरू र अव्यवस्थित सी-टर्मिनल डोमेन (चित्र 6) भित्र हुन्छन्।यी मध्ये एउटा उदाहरणमा, हामीले HLA-A ले LRCH4 (चित्र 6A, D) को अव्यवस्थित N-टर्मिनल टेलसँग अन्तरक्रिया गरेको फेला पारेको छ।LRCH4 ले TLR4 सक्रियता र LPS साइटोकाइन इन्डक्सनलाई नियमन गर्दछ, जसले गर्दा जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया60,61 लाई परिमार्जन गर्दछ।यो एक झिल्ली प्रोटीन हो जसमा नौ ल्युसिन-रिच रिपीट्स (LRRs) र यसको एक्टोडोमेनमा क्याल्मोडुलिन (CH) होमोलोजी मोटिफ हुन्छ, त्यसपछि ट्रान्समेम्ब्रेन डोमेन (TMD) 60, 62।CH डोमेनहरू प्रोटीन-प्रोटिन अन्तरक्रियाहरू मध्यस्थता गर्न रिपोर्ट गरिएको छ 60।LRR र CH डोमेनहरू बीच लगभग 300 एमिनो एसिडहरूको विस्तार अपेक्षाकृत पहुँचयोग्य तर अव्यवस्थित छ।प्रोटीन-प्रोटिन नेटवर्कहरू र भेसिकुलर यातायात 63 को मध्यस्थकर्ताको रूपमा अव्यवस्थित क्षेत्रहरूको प्रकार्यको आधारमा, हामीले पत्ता लगायौं कि प्रायः प्रोटीन अन्तरक्रियाहरू अव्यवस्थित क्षेत्रहरूमा हुन्छन्।MDN1 सँग अन्तरक्रियाहरू LRR1, LRR6, CH डोमेनहरू, र अनियमित क्षेत्रहरू सहित प्रोटीनको सम्पूर्ण लम्बाइमा वितरण गरिएको थियो, जबकि H2B मुख्य रूपमा CH डोमेन (चित्र 6A, B) मा बाँधिएको थियो।विशेष रूपमा, कुनै पनि अन्तरक्रियामा TMJ समावेश थिएन, CLMS दृष्टिकोणको विशिष्टता सुझाव दिन्छ (चित्र 6A, B)।
MDN1 लाई HLA-A प्रोटीन नेटवर्क (चित्र 6A) को भागको रूपमा पनि पहिचान गरिएको छ।यो प्रोटीन को AAA परिवार (विभिन्न गतिविधिहरु संग सम्बन्धित ATPases) को सम्बन्धित छ।यो उही N-टर्मिनल AAA डोमेन हो जसले हेक्सामेरिक रिंगमा संगठित हुन्छ र 60S 64 ribosomal subunit बाट असेंबली कारक हटाउँछ।dynein64,65,66 सँग मिल्दोजुल्दो देखिन्छ।थप रूपमा, Asp/Glu समृद्ध क्षेत्र MIDAS डोमेन (धातु आयन निर्भर साइट) द्वारा पछ्याइएको छ।MDN1 को ठूलो आकार (लगभग 5600 एमिनो एसिड) र राम्रोसँग अध्ययन गरिएको प्रोटीनको साथ यसको सीमित समरूपताको कारण, मानवमा यसको संरचना र कार्यको बारेमा थोरै थाहा छ।हामीले HLA-A, H2B, र LRCH4 लाई MDN1 बाध्यकारी साझेदारहरूको रूपमा पहिचान गर्यौं र PyMol (चित्र 6A,B) मा प्रोटीन कम्प्लेक्सको रूपमा तिनीहरूको अभिमुखीकरण प्रकट गर्‍यौं।यी तीन प्रोटीनहरूले AAA डोमेन, dynein-like linker डोमेन, र सम्भवतः MIDAS MDN1 डोमेनसँग अन्तरक्रिया गर्दछ।अघिल्लो रिपोर्टमा, प्रलोभन प्रोटीनहरूको आत्मीयता शुद्धिकरणले MDN1 लाई हिस्टोन H2B67 सँग सम्बन्धित प्रोटीनको रूपमा पहिचान गर्‍यो।थप रूपमा, भर्खरैको अध्ययनले HCT116 कोशिकाहरूमा MDN र HLA-B बीचको अन्तर्क्रिया पनि रिपोर्ट गर्‍यो, जसले हाम्रो निष्कर्षहरूलाई समर्थन गर्दै, एफिनिटी-शुद्ध मास स्पेक्ट्रोमेट्री प्रयोग गरेर68।IFNα-उपचार गरिएका नमूनाहरूमा यस जटिलको पहिचानले इन्टरफेरोन सिग्नलिङमा MDN1 को भूमिकाको सुझाव दिन्छ।
HLA जीनहरू अत्यधिक बहुरूपी भएकाले, हामीले Flo-1 कोशिकाहरूको RNA अनुक्रमणिका डेटाबाट HLA-A, -B, र -C म्यापिङ पढ्ने अनुक्रम निकाल्यौं (डेटा देखाइएको छैन)।पेप्टाइड अनुक्रम अनुक्रम पढाइ संग संगतले HLA-A (चित्र S3) मा क्रस-लिंक गरिएका पेप्टाइडहरू रहेका क्षेत्रहरूमा HLA-A, -B, र -C बीचको महत्त्वपूर्ण भिन्नताहरू प्रकट गर्यो।थप रूपमा, हामीले H2B/HMGA1/MDN1/LRCH4 प्रोटीनहरूसँग HLA-B/C अणुहरूको प्रोटीन-देखि-प्रोटीन क्रस-लिङ्किङ अवलोकन गरेनौं।यसले HLA-A, MDN1, LRCH1 र HMGA1 बीच पाइने प्रोटीन अन्तरक्रिया HLA-A विशिष्ट हो भनी सुझाव दिन्छ।थप रूपमा, गैर-क्रसलिङ्क गरिएका नमूनाहरू (तालिका S4) को प्रोटोमिक विश्लेषणले HLA-B वा HLA-C को तुलनामा HLA-A सँग उच्च अनुक्रम कभरेज रहेको देखाएको छ।HLA-A का लागि पहिचान गरिएका पेप्टाइडहरू IFNα-उपचार गरिएका र उपचार नगरिएका नमूनाहरूमा तीव्रतामा उच्च थिए।
यहाँ पहिचान गरिएका अन्तरक्रियाहरू नजिकको स्थानिय निकटतामा दुई प्रोटिनहरूको गैर-विशिष्ट क्रस-लिङ्किङको कारणले होइन भनेर सुनिश्चित गर्न, हामीले सह-इम्युनोप्रेसिपिटेशन एसेसहरू प्रदर्शन गरेर दुई नयाँ HLA-A अन्तरक्रिया गर्ने कारकहरू थप पुष्टि गर्यौं।IFNα-उपचार र उपचार नगरिएको Flo-1 कोशिकाहरू (चित्र 7, चित्र S4) दुवैमा अन्तर्जात MDN1 र H2B सँग HLA-A अन्तरक्रियाहरू पत्ता लगाइयो।हामीले पुष्टि गर्यौं कि HLA-A H2B द्वारा इम्युनोप्रेसिपिटेटहरूमा कब्जा गरिएको थियो र यो एसोसिएशन IFNα उपचारको कारणले गर्दा HLA-A उपचार नगरिएका कोशिकाहरू (चित्र 7A) बाट इम्युनोप्रेसिपिटेट नमूनाहरूमा अनुपस्थित थियो।जे होस्, हाम्रो डेटाले सुझाव दिन्छ कि IFNα ले H2B र MDN1 लाई HLA-A बाध्यकारी रूपमा विनियमित गर्दछ।IFNα ले H2B र HLA-A बीचको सम्बन्धलाई प्रेरित गर्छ, तर MDN1 सँगको सम्बन्ध घटाउँछ।हामीले पत्ता लगायौं कि MDN1 नियन्त्रणहरूमा HLA-A सँग सम्बन्धित थियो, र IFNα को थपले IFNα (चित्र 7B, C) द्वारा MDN1 इन्डक्शनबाट स्वतन्त्र यो अन्तरक्रियालाई कम गर्यो।थप रूपमा, HLA-A प्रतिरक्षाले A549 कोशिकाहरूमा H2B कब्जा गर्‍यो (चित्र S4), सुझाव दिन्छ कि यो अन्तरक्रिया सेल प्रकारबाट स्वतन्त्र छ।सँगै लिएर, यी परिणामहरूले H2B र MDN1 सँग HLA-A को इन्टरफेरोन-मध्यस्थता अन्तरक्रियाहरूलाई समर्थन गर्दछ।
HLA-A ले H2B र MDN1 को सह-शुद्ध गर्दछ।प्रतिनिधि अन्तर्जात H2B (A) र MDN1 (B) इम्युनोब्लटहरू IFNα-उपचार गरिएको Flo-1 कोशिकाहरूबाट प्रतिरक्षा गरिएको थियो र संकेत गरिएको एन्टिबडीहरूको लागि जाँच गरियो।माउस र खरगोश IgG नकारात्मक नियन्त्रणको रूपमा प्रयोग गरियो।(C) विभिन्न एन्टिजनहरूको सापेक्ष मात्रा (इनपुट) संकेतित एन्टिबडीहरू विरुद्ध जाँच गरिएको इम्युनोब्लोट्स द्वारा चित्रण गरिएको छ, β-actin लोडिङ नियन्त्रणको रूपमा प्रयोग गरिएको थियो।
इन्टरफेरोन-प्रेरित अत्यधिक भरपर्दो क्रस-लिङ्क गरिएका नेटवर्कहरू मध्ये एकको संरचनात्मक गुणहरू, H2B-HLA-A-HMGA1, अनुसन्धान गरियो।हामीले यस जटिल (चित्र 8) मा संलग्न प्रोटीनहरूको संरचनात्मक गतिशीलता बुझ्न वैकल्पिक दृष्टिकोणको रूपमा आणविक गतिशीलता मोडेलिङ प्रयोग गर्यौं।CLMS डेटाबाट निष्कर्षहरूले H2B, HLA-A, र HMGA1 प्रोटीनहरूको विभिन्न रूपान्तरणको सम्भावनालाई सुझाव दिन्छ।तसर्थ, निम्न सम्भावित परिसरहरू विलायक माध्यममा मोडेल गरिएको थियो: H2B-HLA-A, HMGA1-HLA-A, र H2B-HLA-A-HMGA1।MOE (आण्विक अपरेटिङ वातावरण; केमिकल कम्प्युटिङ ग्रुप इंक., मोन्ट्रियल, क्युबेक, क्यानाडा) प्याकेज प्रयोग गरी प्रारम्भिक प्रोटीन-प्रोटिन डकिङ स्क्रिनले यी प्रोटीनहरू (चित्र 8A) बीच फरक हुने सम्भावित कन्फर्मेसनहरू सुझाव दियो।डकिंग प्रोटीन कम्प्लेक्सको भिजुअलाइजेशनले धेरै अन्तरक्रियाहरू र सम्भावित कन्फर्मेसनहरू प्रकट गर्‍यो (चित्र 5A, 8)।यसरी, एउटा सम्भावित कन्फर्मेसन चित्र 8A मा देखाइएको छ (लेबल गरिएको क्रस-लिङ्कहरूसँग) र यसलाई MD मोडलिङ पाइपलाइन प्रयोग गरेर थप मूल्याङ्कन गरिएको थियो।थप रूपमा, H2B वा HMGA1 लाई HLA-A सँग बाँध्नले HLA-A (चित्र 8A) को लागि H2B को उच्च आत्मीयतालाई हाइलाइट गर्दछ।
H2B (H2BFS)-HLA-A, HMGA1-HLA-A, र H2B-HLA-A-HMGA1 कम्प्लेक्सहरू बीचको सम्भावित नेटवर्कहरूको संरचनात्मक गतिशीलता।(A) बायाँ प्यानल एक 2D नक्सा हो (SIM-XL सफ्टवेयरमा उत्पन्न गरिएको) intramolecular (रातो) र intermolecular (नीलो) क्रसलिङ्कहरू (3.5 मा क्रसलिङ्क कटअफ सेट) को।थप रूपमा, पहिचान गरिएका क्रस-लिङ्किङ अवशेषहरूलाई H2B, HLA-A, र HMGA1 प्रोटीनहरूको संरचनाहरूमा लेबल गरिएको छ।यी प्रोटीनहरूको सम्बद्ध कन्फर्मेसनहरू MOE प्याकेजमा लागू गरिएको डकिंग पाइपलाइन प्रयोग गरेर निकालिएको थियो।तल्लो बायाँ प्यानलले H2B-HLA-A र HMGA1-HLA-A विभिन्न प्रोटीन-प्रोटिन बाध्यकारी सम्बद्धताहरू (GBVI/WSA dG; kcal/mol) को साथ विभिन्न सम्भावित रूपहरू देखाउँछ।(B) प्रत्येक प्रोटीन संरचनाको लागि परमाणु स्थिति (हाइड्रोजन परमाणुहरू बाहेक) को मानक विचलन (RMSD)।(C) अवधि ≥ 10 ns को विशिष्ट अन्तरक्रियाहरू विचार गर्दै विभिन्न सिमुलेटेड कम्प्लेक्सहरूबाट अन्तरआणविक प्रोटीन-प्रोटिन हाइड्रोजन बन्ड अन्तरक्रियाहरू।एच-बन्ड डोनर-स्वीकारकर्ता कटअफ दूरी 3.5 Å मा सेट गरिएको थियो, र डोनर-एच-स्वीकारकर्ता कटअफ कोण ≥ 160°–180° मा सेट गरिएको थियो।(D) डमी HLA-A-H2B र HLA-A-HMGA1 कम्प्लेक्सहरूबाट निकालिएको ≥ 20 ns फैलिएको, तिनीहरूका सम्बन्धित साझेदारहरूसँग HLA-A प्रोटीन-प्रोटिन अन्तरक्रियाहरू बनाउने लेबल गरिएको अवशेषहरू।प्रोटीन संरचना 100 ns MDS को औसत संरचना प्रतिनिधित्व गर्दछ।(E) HLA-A-H2B र HLA-A-HMGA1 कम्प्लेक्सहरू बीचको अन्तरक्रियाहरू H2B-HLA सिमुलेशनले 100 ns भन्दा बढी दुई पेप्टाइडहरू बीचको K वा S अन्तरक्रिया साइटको आधारमा ट्र्याक गरिएका अन्तरक्रियाहरूको तुलनामा।कम्प्लेक्सहरू /HMGA1-HLA-A/H2B-HLA-A-HMGA1।क्रस-लिङ्कहरूको मूल्याङ्कनका लागि थ्रेसहोल्ड मान 3.0 मा सेट गरिएको थियो, र MDS बाट ≥ 10 ns लिने विशिष्ट अन्तरक्रियाहरूलाई ध्यानमा राखिएको थियो।BIOVIA डिस्कवरी स्टुडियो (Dassault Systèmes, BIOVIA Corp., San Diego, CA, USA) र Molecular Operating Environment (MOE; केमिकल कम्प्युटिङ ग्रुप इंक., मोन्ट्रियल, क्युबेक, क्यानडा) प्याकेजहरू प्रयोग गरेर प्रोटीन संरचनाहरू कल्पना गरिएको थियो।
समयसँगै HLA-A अणुहरूको स्थिरता (मानक विचलन; RMSD वा मानक विचलन; RMSF) ले संकेत गर्यो कि परिसरहरूमा H2B वा HMGA1 प्रोटीनहरूको उपस्थितिले HLA-A (चित्र 8B, चित्र S5) लाई स्थिर बनायो।HMGA1 प्रोटिनले HLA-A को B2M साइटमा कडा रूपमा बाँध्छ, HLA-A-HMGA1 वा H2B-HLA-A-HMGA1 कम्प्लेक्स (चित्र 8B, चित्र S5) मा HLA-A एमिनो एसिडको स्थिरतालाई प्रेरित गर्दछ।विशेष गरी, HLA अवशेषहरू ~60-90 र ~180-210 H2B (FIG। 8B) को उपस्थितिमा कम लचिलो भएको पाइयो।H2B र HMGA1 ले H2B-HLA-A-HMGA1 कम्प्लेक्समा HLA-A लाई H2B वा HMGA1 एक्लै बाइन्डिङको तुलनामा HLA-A लाई राम्रो बन्धन देखायो (चित्र 8C, D; तालिका S5)।हाइड्रोजन बन्धनमा संलग्न अवशेषहरू (MD मोडेल उच्च अधिभोग ≥ 10 ns) कम्प्लेक्समा CLMS अन्तरक्रिया साइटहरू (K वा S अवशेषहरू) सँग मेल खान्छ, सुझाव दिन्छ कि CLMS द्वारा पहिचान गरिएका अन्तरक्रियाहरू धेरै भरपर्दो छन्।विश्वसनीयता (चित्र 8E)।CLMS र MD मोडलिङमा, HLA-A अवशेषहरू लगभग 190-210 र लगभग 200-220 एमिनो एसिडहरू क्रमशः H2B र HMGA1 लाई बाँध्न पाएका थिए (FIG। 8E)।
प्रोटीन-प्रोटिन अन्तरक्रियाहरूले गतिशील संरचनात्मक सञ्जालहरू बनाउँछ जुन निश्चित उत्तेजनाहरूको प्रतिक्रियामा इन्ट्रासेलुलर संचार मध्यस्थता गर्दछ।किनभने धेरै प्रोटियोमिक्स दृष्टिकोणहरूले प्रोटीनको समग्र स्थिर अवस्था स्तरमा परिवर्तनहरू पत्ता लगाउँछन्, प्रोटीन-प्रोटिन अन्तरक्रिया गतिशीलतालाई बाध्यकारी इन्टरफेसहरू क्याप्चर गर्न थप उपकरणहरू चाहिन्छ, र CLMS एउटा यस्तो उपकरण हो।इन्टरफेरोन सिग्नलिङ सिस्टम एक साइटोकाइन नेटवर्क हो जसले कोशिकाहरूलाई वातावरणीय रोगजनक र आन्तरिक रोगविज्ञान संकेतहरूको दायरामा प्रतिक्रिया दिन अनुमति दिन्छ, इन्टरफेरोन-इन्ड्युसिबल प्रोटीनहरूको सबसेटहरूको समापनमा परिणत हुन्छ।हामीले CLMS लागू गर्यौं कि यदि उपन्यास प्रोटीन-प्रोटिन अन्तरक्रियाहरू इन्टरफेरोन-प्रेरित प्रोटीनहरूको प्यानल बीच पहिचान गर्न सकिन्छ।इन्टरफेरोन-उत्तरदायी Flo-1 सेल मोडेलमा ग्लोबल प्रोटीन क्रस-लिङ्किङ विश्लेषण प्रोटीन कम्प्लेक्सहरू क्याप्चर गर्न प्रयोग गरिएको थियो।गैर-क्रस-लिङ्क गरिएको र क्रस-लिङ्क गरिएको कोशिकाहरूबाट ट्रिप्टिक पेप्टाइडहरूको निकासीले पेप्टाइड गणना, मार्ग संवर्धन, र परिभाषित LFQ तीव्रताको साथ पेप्टाइड लम्बाइ वितरणको लागि अनुमति दिन्छ।क्यानोनिकल इन्टरफेरोन-इन्ड्युसिबल प्रोटीनहरूलाई सकारात्मक आन्तरिक नियन्त्रणको रूपमा पहिचान गरिएको थियो, जबकि MX1, UP18, OAS3 र STAT1 जस्ता क्यानोनिकल इन्टरफेरोन-इन्ड्युसिबल प्रोटीनहरूको नयाँ इन्टरमोलिक्युलर र इन्ट्रामोलिक्युलर क्रस-लिंक्ड एडक्टहरू अवलोकन गरियो।कार्यात्मक क्षेत्रहरूमा विभिन्न संरचनात्मक सुविधाहरू र अन्तरक्रियाहरू अनुसन्धान गरिएको छ।
HLA-A, MDN1 र H2B बीचको अन्तरक्रिया Flo-1 र A549 कोषहरूमा इम्युनोब्लोटिंग द्वारा पत्ता लगाइएको थियो र IFNα सँग उपचार नगरिएको थियो।हाम्रो परिणामहरूले हाइलाइट गर्दछ कि HLA-A जटिल H2B सँग IFNα-निर्भर रूपमा।हाम्रो कामले यी दुई कम्प्लेक्सहरूको सह-स्थानीयकरणको थप अन्वेषणको लागि एक रोचक अवसर प्रतिनिधित्व गर्दछ।सेल-प्रकार-स्वतन्त्र इन्टरफेरोन-मध्यस्थ प्रोटीन अन्तरक्रियाहरू पहिचान गर्न सेल लाइनहरूको प्यानलमा CLMS दृष्टिकोण विस्तार गर्न पनि रोचक हुनेछ।अन्तमा, हामीले H2BFS-HLA-A-HMGA1 कम्प्लेक्समा संलग्न प्रोटीनहरूको संरचनात्मक गतिशीलता बुझ्न वैकल्पिक दृष्टिकोणको रूपमा MD मोडलिङ प्रयोग गर्‍यौं, जसले इन्ट्रामोलिक्युलर र इन्टरमोलिक्युलर क्रस-वार्ताहरू ट्र्याक गर्‍यो।CLMS डेटाबाट निष्कर्षहरूले H2BFS, HLA-A, र HMGA1 प्रोटीनहरूको विभिन्न रूपान्तरणको सम्भावनालाई सुझाव दिन्छ।यी डकिंग प्रोटीन कम्प्लेक्सहरू बीचको सम्भावित फरक कन्फर्मेसनहरूले CLMS डाटासेटमा अवलोकन गरिएका जस्तै धेरै अन्तरक्रियाहरू प्रकट गर्‍यो।हाम्रो विधिको मुख्य शक्तिहरू मध्ये एक यो हो कि यसले HLA जस्ता उच्च पोलिमोर्फिक जीनहरू अन्तरक्रिया गर्न सजिलो पहिचान गर्न अनुमति दिन्छ, त्यसैले यो HLA ह्याप्लोटाइप-विशिष्ट प्रोटीनहरूको अन्तरक्रिया अध्ययन गर्न रोचक हुनेछ जुन अन्यथा अध्ययन गर्न गाह्रो हुन्छ।सँगै लिइएको, हाम्रो डेटाले इन्टरफेरोन-प्रेरित सिग्नलिंग नेटवर्कहरूको हाम्रो बुझाइ विस्तार गर्न र ट्यूमर सूक्ष्म वातावरणमा थप जटिल इन्टरसेलुलर प्रणालीहरूको अध्ययनको लागि आधार प्रदान गर्न CLMS प्रयोग गर्न सकिन्छ भनेर देखाउँछ।
Flo-1 कोशिकाहरू ATCC बाट प्राप्त गरियो र DMEM (Gibco) मा 1% पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन (इनभिट्रोजन), 10% भ्रूण बोवाइन सीरम (Gibco) को साथमा राखियो र 37°C र 5% CO2 मा भण्डारण गरियो।इन्क्युबेशन।IFNα14 (एडिनबर्ग प्रोटिन उत्पादन सुविधा द्वारा निर्मित) संग उपचार गर्नु अघि कोशिकाहरू 70-80% संगममा बढेका थिए।अन्य सबै रसायन र अभिकर्मकहरू सिग्मा एल्ड्रिचबाट खरिद गरिएका थिए जबसम्म अन्यथा उल्लेख गरिएको थिएन।
Flo-1 कोषहरूलाई 6-वेल प्लेटहरूमा कल्चर गरिएको थियो र अर्को दिन कोशिकाहरूलाई 10 ng/ml IFNα14 24 घण्टाको लागि लगभग 80% संगममा उपचार गरियो।कोशिकाहरूलाई PBS बाट तीन पटक धोइयो र PBS मा ताजा तयार DSS (थर्मो फिशर साइन्टिफिक) (DMSO मा घुलनशील) 5 मिनेटको लागि 37° C. मा 0.5 mM को अन्तिम एकाग्रतामा लगाइयो।DSS क्रसलिङ्किङ प्रतिक्रियालाई PBS द्वारा प्रतिस्थापित गरियो र अवशिष्ट DSS PBS मा 15 मिनेटको लागि 37° C मा 20 mM Tris (pH 8.0) थपेर निभाइयो।कोशिकाहरू स्क्र्याप गरेर सङ्कलन गरियो र कम बाइन्डिङ ट्यूबहरू (Axygen) मा सङ्कलन गरियो।
सेल गोली 300 μl यूरिया लाइसिस बफर (8 एम यूरिया, 0.1 एम ट्रिस, पीएच 8.5) को साथ 30 मिनेटको लागि कोठाको तापक्रममा कहिलेकाहीं हल्लाइयो।सबै centrifugation चरणहरू 14,000 xg मा 8°C मा प्रदर्शन गरियो।10 मिनेटको लागि लाइसेट सेन्ट्रीफ्यूज गर्नुहोस् र सुपरनेटेन्टलाई नयाँ ट्यूबमा स्थानान्तरण गर्नुहोस्।बाँकी स्पष्ट कणहरू दोस्रो लिसिस बफरको 150 μl (2 M यूरिया, 2% (w/v) SDS (सोडियम डोडेसाइल सल्फेट)) मा 30 मिनेट वा सोभन्दा बढीको लागि एकसमान जलीय समाधान प्राप्त नभएसम्म भंग गरियो।लाइसेटलाई २० मिनेटको लागि सेन्ट्रीफ्युज गरिएको थियो र सुपरनेटेन्टलाई अघिल्लो चरणमा प्राप्त गरिएको लिसेटसँग मिसाइएको थियो।माइक्रोप्लेट प्रक्रियाहरूको लागि निर्माताको निर्देशन अनुसार माइक्रो बीसीए परख (थर्मो फिशर वैज्ञानिक) प्रयोग गरेर प्रोटीन सांद्रताको मूल्याङ्कन गरिएको थियो।नमूनाहरू द्रुत रूपमा तरल नाइट्रोजनमा जमे भएका थिए र -80 डिग्री सेल्सियसमा भण्डारण गरियो।
लगभग 100 μg घुलनशील क्रस-लिङ्क गरिएको प्रोटीनलाई परिमार्जित फिल्टरेशन नमूना तयारी प्रोटोकल (FASP) प्रयोग गरी प्रशोधन गरिएको थियो जसलाई Wisniewski et al द्वारा वर्णन गरिएको छ।69 छोटकरीमा, प्रोटिनलाई 200 μl यूरिया बफर (0.1 M Tris मा 8 M यूरिया, pH 8.5) सँग क्रसलिङ्क गरिएको छ, भर्टेक्स र आधा गरिएको छ।सबै सेन्ट्रीफ्युगेशन चरणहरू 14,000 xg मा 25°C मा प्रदर्शन गरियो।क्रस-लिंक गरिएको प्रोटीन लाइसेटको पहिलो आधा अल्ट्रासेल-१० झिल्ली (मर्क) संग सुसज्जित १० kDa माइक्रोकन सेन्ट्रीफ्यूगल फिल्टर उपकरणमा स्थानान्तरण गरियो, त्यसपछि फिल्टरमा 25 मिनेटको लागि सेन्ट्रीफ्यूगेशन गरियो।त्यसपछि फिल्टरमा प्रोटीनको दोस्रो आधा थप्नुहोस् र उही चरणहरू दोहोर्याउनुहोस्।प्रोटिन रिकभरी यूरिया बफरमा 100 μl 17 एमएम ट्रिस (2-कार्बोक्साइथाइल) फस्फिन हाइड्रोक्लोराइड (TCEP) थपेर प्रदर्शन गरिएको थियो।रिकभरीलाई थर्मोमिक्सरमा ६०० आरपीएममा ३७ डिग्री सेल्सियसमा ३० मिनेटको लागि हलचल गरिएको थियो।थप रूपमा, स्तम्भ सेन्ट्रीफ्युज गरिएको थियो र युरिया बफरमा 50 एमएम आयोडोएसिटामाइडको 100 μl प्रयोग गरेर कम गरिएको क्रस-लिङ्क गरिएको प्रोटीनलाई अल्काइलेट गरिएको थियो।अँध्यारोमा 20 मिनेटको लागि कोठाको तापक्रममा alkylation प्रतिक्रिया गरिएको थियो।स्तम्भ घुमाउनुहोस्, स्तम्भको पर्खालहरू 100 μl यूरिया बफरले 3 पटक धुनुहोस्, र त्यसपछि सेन्ट्रीफ्यूज गर्नुहोस्।एउटै अपरेशन 100 एमएम अमोनियम बाइकार्बोनेट को 100 μl प्रयोग गरेर 3 पटक प्रदर्शन गरिएको थियो।Trypsinization अघि, एक नयाँ संग संग्रह ट्यूब बदल्नुहोस्।50 एमएम अमोनियम बाइकार्बोनेट र ट्रिप्सिन बफर (प्रोमेगा) मा 1 μl ट्रिप्सिन पातलो भएको पाचन बफर थप्नुहोस्।ट्रिप्सिन र प्रोटीनको अनुपात लगभग 1:33 मा कायम राखिएको थियो, र पाचन प्रतिक्रियाहरू आर्द्र कक्षमा 37 डिग्री सेल्सियसमा रातभर इन्क्युबेटेड थिए।क्रसलिङ्क गरिएको पेप्टाइडलाई फिल्टरबाट सेन्ट्रीफ्युगेशनद्वारा २५ मिनेटसम्म निकालिएको थियो।फिल्टरमा 0.5 M NaCl को 50 μl थपेर पेप्टाइड रिकभरी सुधार गरियो, त्यसपछि 25 मिनेटको लागि सेन्ट्रीफ्यूगेशन।
C18 माइक्रो स्पिन स्तम्भहरू (Harvard Apparatus) प्रयोग गरियो क्रस-लिङ्क गरिएको ट्रिप्टिक पेप्टाइडहरू डिसल्ट गर्नका लागि Bouchal et al.70 द्वारा वर्णन गरिएको प्रोटोकललाई साना परिमार्जनहरू सहित।छोटकरीमा, C18 स्पिन स्तम्भहरू 0.1% फॉर्मिक एसिड (FA) को acetonitrile (AcN) (Merck) मा तीनवटा धुने र 0.1% FA को दुईवटा वासहरूद्वारा सक्रिय गरिएको थियो।स्तम्भ १५ मिनेटको लागि ०.१% FA सँग हाइड्रेटेड गरिएको थियो।स्पिन स्तम्भहरूमा नमूनाहरू लोड गर्नुहोस् र 0.1% FA को साथ 3 पटक धुनुहोस्।डिसल्टेड पेप्टाइडहरू क्रमशः ०.१% FA मा ५०%, ८०% र १००% AcN प्रयोग गरी चरणबद्ध ढाँचाको साथ एल्युट गरिएको थियो।नमूनाहरू स्पीडभ्याक प्लस कन्सेन्ट्रेटर (एपेन्डोर्फ) मा अवशिष्ट तरल पूर्ण रूपमा गायब नभएसम्म सुकाइयो।एल्युटेड पेप्टाइडहरू 2.5% AcN मा 0.08% ट्राइफ्लुरोएसेटिक एसिडको 100 μl मा भंग गरियो र सांद्रता NanoDrop 2000 (थर्मो वैज्ञानिक) मा मापन गरियो।प्रति नमूना लगभग 1 μg क्रसलिंक पेप्टाइड LC-MS/MS प्रणालीमा इन्जेक्ट गरिएको थियो।
क्रस-लिङ्क गरिएको पेप्टाइडहरू अल्टिमेट 3000 RSLCnano LC प्रणाली (थर्मो साइन्टिफिक) मा एक अर्बिट्राप एक्सप्लोरिस 480 मास स्पेक्ट्रोमिटर (थर्मो वैज्ञानिक) मा जडान गरिएको थियो।क्रस-लिंक गरिएका पेप्टाइडहरू 300 µm आईडीमा, 5 मिमी लामो µ-पूर्व-स्तम्भ C18 क्याप्चर स्तम्भ C18 PepMap100 sorbent र 5 µm PepMap sorbent (थर्मो वैज्ञानिक) सँग प्याक गरिएको थियो।5 μl/मिनेट 0.08% ट्राइफ्लुरोएसेटिक एसिड 2.5% AcN मा घुलनशील पम्प प्रवाह सेट लोड गर्नुहोस्।क्रस-लिंक गरिएका पेप्टाइडहरू विश्लेषणात्मक फ्युज्ड सिलिका स्तम्भमा 75 μm को भित्री व्यास र 150 मिमी लम्बाइको साथ अलग गरिएको थियो, 2 μm PepMap sorbent (थर्मो वैज्ञानिक) भरिएको थियो।मोबाइल चरण A र B मा क्रमशः पानीमा 0.1% FA र acetonitrile मा 0.1% FA समावेश छ।ग्रेडियन्ट 2.5% B बाट सुरु हुन्छ र 90 मिनेटमा 40% B सम्म रैखिक रूपमा बढ्छ, त्यसपछि अर्को 2 मिनेटमा 90% B सम्म पुग्छ।मोबाइल चरण संरचना 10 मिनेटको लागि 90% B मा राखिएको थियो र त्यसपछि 2 मिनेटमा 2.5% B मा रैखिक रूपमा घट्यो।अर्को चक्र अघि 8 मिनेटको लागि स्तम्भ 2.5% B मा सन्तुलन गरिएको थियो।विश्लेषणात्मक स्तम्भबाट निकालिएका क्रस-लिङ्क्ड पेप्टाइडहरू नानोइलेक्ट्रोस्प्रे आयनाइजेशन (NSI) स्रोतमा आयनाइज गरिएको थियो र एक्सप्लोरिस 480 मास स्पेक्ट्रोमिटर (थर्मो साइन्टिफिक) मा इन्जेक्ट गरियो।
Orbitrap Exploris 480 मास स्पेक्ट्रोमिटर सकारात्मक डेटा सहसंबंध मोड मा संचालित।m/z 350 Th देखि m/z 2000 Th सम्म दायरा सेटिङहरूको साथ 120,000 को रिजोल्युसनमा खण्ड मोडमा पूर्ण स्क्यान गरिएको थियो।सामान्यीकृत AGC लक्ष्य 50ms को अधिकतम इनपुट समय संग 300% मा सेट गरिएको थियो।पेप्टाइड्सको लागि मोनोइसोटोपिक शिखर पत्ता लगाउने स्थापना गरिएको छ।यदि धेरै कम पूर्ववर्तीहरू फेला परेका छन् भने बाधा विश्राम प्यारामिटर सही मा सेट गरिएको छ।पूर्ववर्तीको न्यूनतम आयनिक शक्ति 5.0e3 मा सेट गरिएको थियो र +8 सम्म पूर्ववर्ती चार्ज राज्यहरू प्रयोगहरूमा समावेश गरिएको थियो।
डाटा सहसंबंध मोडमा प्रमुख स्क्यानहरू बीचको चक्र समय 2.5 सेकेन्डमा सेट गरिएको थियो।डायनामिक जन बहिष्कार पूर्ववर्ती आयनको पहिलो विखंडन पछि 20 s मा सेट गरिएको थियो।अग्रसर अलगाव विन्डो 2th मा सेट गरिएको थियो।निश्चित टक्कर ऊर्जा मोडको साथ सामान्यीकृत टक्कर ऊर्जाको प्रकार डेटा निर्भर MS/MS स्क्यानमा छनोट गरिएको थियो।टक्कर ऊर्जा 30% मा सेट।अर्बिट्राप रिजोल्युसन 15,000 र AGC लक्ष्य 100% मा सेट गरिएको थियो।अनुकूलन अधिकतम इंजेक्शन समय 60 मिलिसेकेन्डमा सेट गरिएको छ।
क्रस-लिङ्क गरिएको नमूनाहरूमा प्रोटीन-प्रोटिन नेटवर्क ट्र्याक गर्नु अघि, हामीले नमूनाहरूमा ट्रेस गर्न मिल्ने पेप्टाइड्स/प्रोटिनहरू पहिचान गर्न MaxQuant प्याकेज (संस्करण 1.6.12.0) 26,27 प्रयोग गरेर कच्चा फाइलहरूलाई प्रशोधन गर्यौं।थप रूपमा, समान प्रोटियोमिक विश्लेषणहरू IFNα सँग उपचार गरिएको र उपचार नगरिएको अनक्रसलिंक गरिएको Flo-1 नमूनाहरूमा प्रदर्शन गरिएको थियो।MS/MS डाटा UniProt मानव डाटाबेस (www.uniprot.org) मा खोजिएको थियो (अपलोड अगस्ट 12, 2020, 75,093 प्रविष्टिहरू समावेश गर्दछ) निर्मित खोज इन्जिन एन्ड्रोमेडा27 प्रयोग गरेर।इन्जाइमको विशिष्टता र डेमिडेसन (N, Q) र अक्सीकरण (M) को विभिन्न परिमार्जनहरू संकेत नगरी खोजी गरिएको थियो।पूर्ववर्ती जन सहिष्णुता 20 पीपीएम र उत्पादन आयनहरू 0.02 Da मा सेट गरिएको थियो।प्रारम्भिक र अधिकतम जन विचलन 10 ppm मा सेट गरिएको थियो।पेप्टाइडको अधिकतम द्रव्यमान 4600 Da मा सेट गरिएको थियो र अनुक्रम समानता 7 र 25 एमिनो एसिड (aa) बीच सेट गरिएको थियो।थप सांख्यिकीय विश्लेषण Perseus कार्यक्रम (संस्करण 1.6.10.45) को प्रयोग गरी गरिएको थियो।प्रोटिन सामग्री प्रोटीनको वर्णक्रमीय तीव्रता (LFQ तीव्रता; लेबल नगरिएको मात्रा) 27 लाई सामान्य गरेर गणना गरिएको थियो र तीव्रता मानहरू Log2 मा रूपान्तरण गरियो।तिनीहरूको पेप्टाइड तीव्रता द्वारा पहिचान गरिएको प्रोटिनहरूको एक श्रेणीबद्ध क्लस्टरिंग R (v 4.1.2) मा फेटम्याप (v1.0.12) प्याकेज प्रयोग गरेर निर्माण गरिएको थियो।पथवे संवर्धन विश्लेषण IFNα-उपचार गरिएका प्रोटीनहरूको लागि Reactome मार्ग डाटाबेस प्रयोग गरी प्रदर्शन गरिएको थियो जुन उपचार नगरिएका नमूनाहरूको तुलनामा चार गुणा बढी सक्रिय थियो।
LC-MS/MS द्वारा अनुगमन गरिएको प्रोटीन कम्प्लेक्सहरूको लाइसिन (K) वा सेरीन (S) विशिष्ट रासायनिक क्रसलिङ्कहरूको पहिचान क्रस-लिङ्क गरिएको पेप्टाइड्स (SIM-XL) 29 को लागि स्पेक्ट्रोस्कोपिक पहिचान मेसिन (SIM-XL) प्रयोग गरी गरिएको थियो।पहिलो, इन्टरफेरोन-सम्बन्धित (IFN) DNA क्षति प्रतिरोध हस्ताक्षर (IRDS) जीनहरू बीचको सम्भावित अन्तरक्रियाहरू Padariya et al.28 मा वर्णन गरिएको IRDS प्रोटीन डाटासेट प्रयोग गरेर अनुसन्धान गरियो।सम्पूर्ण मानव युनिप्रोटको सबै अवस्था र दोहोर्याइहरूको स्क्रिनिङ कम्प्युटेशनली गहन छ, त्यसैले सम्पूर्ण मानव UniProt डाटाबेस (www.uniprot.org) (12 अगस्त 2020 डाउनलोड गरिएको, 75,093 प्रविष्टिहरू समावेश छन्) IFNα-उपचार दोहोरिने विरुद्ध।उच्च विश्वास अन्तरक्रियाका लागि फिल्टरहरू मध्ये एक।प्राप्त यी उच्च-महत्वपूर्ण अन्तरक्रियाहरू विस्तार र सबै पुनरावृत्ति र सर्तहरूमा परीक्षण गरियो।
SIM-XL मा, DSS लाई क्रसलिङ्कर (XL) को लागि प्रयोग गरिएको थियो र XL वजन शिफ्ट र परिमार्जन वजन शिफ्ट क्रमशः 138.06 र 156.07 मा सेट गरिएको थियो।निम्न क्रसलिङ्किङ प्रतिक्रिया साइटहरू विचार गरिन्छ: KK, KS र KN-TERM, रिपोर्टर आयनहरू बिना।दुबै अग्रसर र टुक्रा ppm 20 मा सेट गरिएको थियो र Xrea थ्रेसहोल्ड 0.15 मा सेट गरिएको थियो।ट्रिप्सिनलाई पूर्ण रूपमा विशिष्ट मानिएको थियो, र उच्च-ऊर्जा सी-ट्र्याप (एचसीडी) खण्डीकरण विधि लागू गरिएको थियो।XCorr गतिशील DB घटाउने थ्रेसहोल्ड र गतिशील DB कटौतीको लागि पेप्टाइडहरूको न्यूनतम संख्या क्रमशः 2.5 र 2 मा सेट गरिएको थियो।अन्य प्यारामिटरहरू हुन्: मोनोइसोटोप सम्भाव्यता र शिखर संयोग कटअफ, न्यूनतम 4 AA अवशेषहरू प्रति स्ट्र्यान्ड र अधिकतम स्ट्र्यान्ड चार्ज, र छुटेका विभाजनहरूको 3 अधिकतम।परिणामस्वरूप स्टिच गरिएको 2D नक्साहरू (SIM-XL) मा विश्लेषण गरियो र xQuest28 ग्राफिकल प्रतिनिधित्व 2D नक्साहरू निर्माण गर्न प्रयोग गरियो।प्रोटीन संरचनाहरूमा प्रोटीन क्रसलिङ्कहरू PyMol (PyMOL आणविक ग्राफिक्स प्रणाली, संस्करण 2.0 Schrödinger, LLC) मा प्रदान गरिन्छ।
प्रोटीन मोडेल संरचनाहरू Phyre2 सर्भर (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) 11 प्रयोग गरेर "हिडेन मार्कोभ विधि" को होमलोजी मोडलिङ र कार्यान्वयनका सिद्धान्तहरू प्रयोग गरेर सिर्जना गरिएको थियो।Phyre2 ले ज्ञात प्रोटीन संरचनाहरूसँग अनुक्रम पङ्क्तिबद्धतामा आधारित मोडेल संरचनाहरू उत्पन्न गर्दछ।H2BFS, HLA-A, HMGA1, LRCH4, र MDN1 प्रोटीनहरूको लागि, टेम्प्लेट संरचनाहरू 1kx552, 1kj349, 2eze55, 6hlu62, र 6i2665 प्रयोग गरियो।साथै, AlphaFold71 MX1, UBP18 र ROBO1 को संरचना पनि विचार गरियो।BIOVIA डिस्कवरी स्टुडियो भिजुअलाइजर प्याकेज (Dassault Systèmes, BIOVIA, San Diego, CA, USA) र Molecular Operating Environment प्याकेज (MOE; केमिकल कम्प्युटिङ ग्रुप इंक., मोन्ट्रियल, क्युबेक, क्यानाडा) को प्रयोग गरेर प्रोटीन संरचनाको कल्पना गरिएको थियो।