347 12.7*1.24mm स्टेनलेस स्टील कोइल्ड ट्युबिङ, सिंक्रोनस इलेक्ट्रोस्टेटिक कन्डेन्सेसनको आणविक संयन्त्र र α-synuclein र tau को coaggregation

Nature.com भ्रमण गर्नुभएकोमा धन्यवाद।तपाईं सीमित CSS समर्थनको साथ ब्राउजर संस्करण प्रयोग गर्दै हुनुहुन्छ।उत्तम अनुभवको लागि, हामी तपाईंलाई अपडेट गरिएको ब्राउजर प्रयोग गर्न सिफारिस गर्छौं (वा इन्टरनेट एक्सप्लोररमा अनुकूलता मोड असक्षम गर्नुहोस्)।थप रूपमा, निरन्तर समर्थन सुनिश्चित गर्न, हामी शैलीहरू र जाभास्क्रिप्ट बिना साइट देखाउँछौं।
स्लाइडरहरू प्रति स्लाइड तीन लेखहरू देखाउँदै।स्लाइडहरू मार्फत सार्नको लागि पछाडि र अर्को बटनहरू प्रयोग गर्नुहोस्, वा प्रत्येक स्लाइडमा सार्नको लागि अन्तमा स्लाइड नियन्त्रक बटनहरू प्रयोग गर्नुहोस्।

347 स्टेनलेस स्टील पाइप विशिष्टता

347 12.7*1.24mm स्टेनलेस स्टील कोइल्ड ट्युबिङ

बाहिरी व्यास: 914.4 mm OD सम्म 6.00 mm OD, 24 " NB सम्मको साइज उपलब्ध एक्स-स्टक, OD साइज स्टिल ट्युबहरू उपलब्ध एक्स-स्टक

SS 347 पाइप मोटाई दायरा: 0.3mm - 50 मिमी, SCH 5, SCH10, SCH 40, SCH 80, SCH 80S, SCH 160, SCH XXS, SCH XS
WT: SCH5S, SCH10S, SCH40S, SCH80S, SCH160S, आदि। (०.५-१२ मिमी) वा गैर-नियमित आकार आवश्यकता अनुसार मिलाइन्छ।

प्रकार: SS 347 सिमलेस पाइपहरू |SS 347 ERW पाइपहरू |SS 347 वेल्डेड पाइप |SS 347 फेब्रिकेटेड पाइपहरू |SS 347 CDW ट्यूबहरू, LSAW पाइपहरू / सीम-वेल्डेड / पुन: कोरिएको

फारम: SS 347 राउन्ड पाइपहरू/ ट्यूबहरू, SS 347 स्क्वायर पाइपहरू/ ट्यूबहरू, SS 347 आयताकार पाइपहरू/ ट्यूबहरू, SS 347 कुण्डलित ट्युबहरू, SS 347 “U” आकार, SS 347 प्यान केक कुण्डलहरू, SS 347 Hydras Tubes

लम्बाइ: एकल यादृच्छिक, दोहोरो अनियमित र आवश्यक लम्बाइ अन्त्य: सादा अन्त्य, बेभल्ड एन्ड, ट्रेडेड

अन्त्य संरक्षण: प्लास्टिक टोपी |बाहिर फिनिश: 2B, No.4, No.1, No.8 स्टेनलेस स्टील पाइपहरूको लागि मिरर फिनिश, ग्राहक आवश्यकता अनुसार समाप्त

डेलिभरी अवस्था: एनील्ड र पिकल्ड, पालिस, उज्यालो एनील्ड, कोल्ड ड्रन

निरीक्षण, परीक्षण रिपोर्टहरू: मिल परीक्षण प्रमाणपत्रहरू, EN 10204 3.1, रासायनिक रिपोर्टहरू, मेकानिकल रिपोर्टहरू, PMI परीक्षण रिपोर्टहरू, दृश्य निरीक्षण रिपोर्टहरू, तेस्रो पक्ष निरीक्षण रिपोर्टहरू, NABL स्वीकृत प्रयोगशाला रिपोर्टहरू, विनाशकारी परीक्षण रिपोर्ट, गैर विनाशकारी परीक्षण रिपोर्टहरू

प्याकिङ: काठको बक्समा प्याक गरिएको, प्लास्टिकको झोला, स्टिल स्ट्रिपहरू बन्डल गरिएको, वा ग्राहकको अनुरोध अनुसार

विशेष: माथि बाहेक आकार र निर्दिष्टीकरण अनुरोध मा निर्माण गर्न सकिन्छ

SS 347 पाइप साइज दायरा: 1/2 इन्च NB, OD देखि 24 इन्च

ASTM A312 347: उच्च तापक्रम र सामान्य संक्षारक सेवाको लागि अभिप्रेरित सिमलेस र सीधा-सीम वेल्डेड अस्टेनिटिक पाइप।वेल्डिंगको समयमा फिलर धातुलाई अनुमति छैन।

ASTM A358 347: संक्षारक र/वा उच्च तापक्रम सेवाको लागि इलेक्ट्रिक फ्यूजन वेल्डेड अस्टेनिटिक पाइप।सामान्यतया 8 इन्च सम्मको पाइप मात्र यस विशिष्टतामा उत्पादन गरिन्छ।वेल्डिंगको समयमा फिलर धातु थप्न अनुमति दिइएको छ।

ASTM A790 347: सिमलेस र सीधा-सीम वेल्डेड फेरीटिक/अस्टेनिटिक (डुप्लेक्स) पाइप सामान्य संक्षारक सेवाको लागि, तनाव जंग क्र्याकिंग प्रतिरोधमा विशेष जोड दिएर।

ASTM A409 347: स्ट्रेट-सीम वा सर्पिल-सीम ​​इलेक्ट्रिक फ्युजन वेल्डेड ठूलो व्यासको अस्टेनिटिक लाइट-वाल पाइप 14" देखि 30" आकारमा पर्खालहरू Sch5S र Sch 10S संग संक्षारक र/वा उच्चको लागि

ASTM A376 347: उच्च तापमान अनुप्रयोगहरूको लागि सिमलेस अस्टेनिटिक पाइप।

ASTM A813 347: उच्च तापमान र सामान्य संक्षारक अनुप्रयोगहरूको लागि एकल-सीम, एकल- वा डबल-वेल्डेड अस्टेनिटिक पाइप।

ASTM A814 347: उच्च तापक्रम र सामान्य संक्षारक सेवाको लागि चिसो काम गरिएको वेल्डेड अस्टेनिटिक पाइप।

347H स्टेनलेस स्टील पाइप रासायनिक संरचना

स्टेनलेस स्टील 347H पाइप मेकानिकल गुण

स्टेनलेस स्टील 347H पाइप भौतिक गुण

347H स्टेनलेस स्टील पाइप को लागि बराबर ग्रेड

Amyloid alpha-synuclein (αS) aggregation पार्किन्सन्स रोग र अन्य synucleinopathies को एक विशेषता हो।हालसालै, सामान्यतया अल्जाइमर रोगसँग सम्बन्धित टाउ प्रोटीन αS रोगविज्ञानसँग सम्बन्धित छ र αS- सम्पन्न समावेशहरूमा सह-स्थानीयकरण भएको पाइन्छ, यद्यपि दुई प्रोटीनहरूको एकत्रीकरणको आणविक संयन्त्र अस्पष्ट छ।हामी यहाँ रिपोर्ट गर्छौं कि αS चरण इलेक्ट्रोस्टेटिक जटिल संक्षेपण मार्फत तरल कन्डेनसेटहरूमा अलग हुन्छ जसमा सकारात्मक चार्ज गरिएको पोलिपेप्टाइडहरू जस्तै टाउ।पोलिकेसनहरूका लागि αS को आत्मीयता र कोगुलेसन नेटवर्कको भ्यालेन्स घटाउने दरमा निर्भर गर्दै, क्लटहरू द्रुत गेलेसन वा एकीकरणबाट गुज्र्छन् र पछि ढिलो एमाइलोइड एकत्रीकरण हुन्छ।उन्नत बायोफिजिकल प्रविधिहरूको एक सूट संयोजन गरेर, हामीले तरल-तरल αS/Tau चरण विभाजनको विशेषताहरू र तरल प्रोटीन कन्डेनसेटमा दुवै प्रोटीनहरू समावेश गर्ने विषम समुच्चयहरूको गठनमा नेतृत्व गर्ने मुख्य कारकहरू पहिचान गर्न सक्षम भयौं।
झिल्ली कम्पार्टमेन्टहरूका अतिरिक्त, कोशिकाहरूमा स्थानिय विभाजनलाई तरल-तरल चरण विभाजन (LLPS) भनेर चिनिने प्रक्रिया मार्फत प्रोटिन-समृद्ध, तरल-जस्तै घना शरीरहरूलाई बायोमोलेक्युलर कन्डेन्सेट वा थोपाहरू भनिने गरी प्राप्त गर्न सकिन्छ।यी थोपाहरू बहुसंयोजक अस्थायी अन्तरक्रियाद्वारा बनाइन्छ, सामान्यतया प्रोटीन वा प्रोटीन र आरएनए बीच, र लगभग सबै जीवित प्रणालीहरूमा विभिन्न प्रकारका कार्यहरू सेवा गर्दछ।LLP-सक्षम प्रोटीनहरूको ठूलो संख्याले कम जटिलताको अनुक्रमहरू प्रदर्शन गर्दछ जुन प्रकृतिमा अत्यधिक अव्यवस्थित हुन्छ र बायोमोलिक्युलर कन्डेनसेटको गठनमा 3,4,5।धेरै प्रयोगात्मक अध्ययनहरूले यी तरल-जस्तै कन्डेनसेटहरू बनाउने प्रोटीनहरूको लचिलो, प्रायः अव्यवस्थित, र बहुसंयोजक प्रकृतिको खुलासा गरेको छ, यद्यपि विशेष आणविक निर्धारकहरूको बारेमा थोरै थाहा छ जसले यी कन्डेनसेटहरूको वृद्धि र परिपक्वतालाई अझ ठोस-जस्तै नियन्त्रण गर्दछ। राज्य।।
नयाँ डाटाले यो परिकल्पनालाई समर्थन गर्दछ कि एबरेन्ट प्रोटीन-संचालित LLPS र ठोस संरचनाहरूमा थोपाहरूको रूपान्तरण प्रासंगिक सेलुलर मार्गहरू हुन सक्छ जसले अघुलनशील विषाक्त समुच्चयहरूको गठन गर्न नेतृत्व गर्दछ जुन प्रायः डिजेनेरेटिभ रोगहरूको विशेषता हो।धेरै LLPS-सम्बन्धित आन्तरिक रूपमा विकारित प्रोटिनहरू (IDPs), प्रायः अत्यधिक चार्ज र लचिलो, लामो समयदेखि अमिलोइड एकत्रीकरणको प्रक्रिया मार्फत न्यूरोडिजेनरेशनसँग सम्बन्धित छन्।विशेष गरी, FUS7 वा TDP-438 जस्ता बायोमोलेक्युलर IDP कन्डेनसेटहरू वा hnRNPA19 जस्ता ठूला कम जटिलता डोमेनहरू भएका प्रोटिनहरूलाई तरलीकरण भनिने प्रक्रिया मार्फत जेल-जस्तो वा ठोस रूपहरूमा उमेर देखाइएको छ।यौगिक।ठोस चरण संक्रमण (LSPT) को समय को एक प्रकार्य को रूप मा वा केहि पोस्ट-अनुवादात्मक परिमार्जन वा रोगशास्त्रीय रूपमा महत्त्वपूर्ण उत्परिवर्तन को प्रतिक्रिया मा 1,7।
भिवोमा LLPS सँग सम्बन्धित अर्को IDP Tau हो, एक माइक्रोट्यूब्युल-सम्बन्धित विकारयुक्त प्रोटीन जसको एमाइलोइड एग्रीगेशन अल्जाइमर रोग 10 मा निहित छ तर हालसालै पार्किन्सन्स रोग (PD) र अन्य synaptic आणविक प्रोटीनोप्याथी 11, 12, 13 सम्बन्धित छन्।Tau अनुकूल इलेक्ट्रोस्टेटिक अन्तरक्रियाको कारणले समाधान/साइटोप्लाज्मबाट सहज रूपमा अलग भएको देखाइएको छ, जसको परिणामस्वरूप तउ-समृद्ध थोपाहरू बन्न सकिन्छ जसलाई इलेक्ट्रोस्टेटिक कोसेर्भेट्स भनिन्छ।यो पनि अवलोकन गरिएको छ कि यस प्रकारको गैर-विशिष्ट अन्तरक्रिया प्रकृतिमा धेरै बायोमोलेक्युलर कन्डेनसेटहरू पछाडिको चालक शक्ति हो15।टाउ प्रोटीनको मामलामा, इलेक्ट्रोस्टेटिक एग्रीगेशन साधारण एग्रीगेसनद्वारा बन्न सकिन्छ, जसमा प्रोटिनको विपरीत चार्ज गरिएका क्षेत्रहरूले क्लीभेज प्रक्रियालाई ट्रिगर गर्छ, वा आरएनए जस्ता नकारात्मक चार्ज गरिएका पोलिमरहरूसँग अन्तरक्रिया मार्फत जटिल एकत्रीकरणद्वारा।
हालै, α-synuclein (αS), PD र अन्य neurodegenerative रोगहरूमा संलग्न एक amyloid IDP लाई सामूहिक रूपमा synucleinopathy17,18 भनेर चिनिन्छ, तरल पदार्थ जस्तो व्यवहारको साथ प्रोटीन कन्डेनसेटहरूमा केन्द्रित सेलुलर र पशु मोडेलहरू 19,20 मा प्रदर्शन गरिएको छ।इन भिट्रो अध्ययनहरूले देखाएको छ कि αS ले मुख्यतया हाइड्रोफोबिक अन्तरक्रियाहरू मार्फत साधारण एकत्रीकरणद्वारा LLPS पार ​​गर्छ, यद्यपि यस प्रक्रियालाई असाधारण रूपमा उच्च प्रोटीन सांद्रता र atypically लामो इन्क्युबेशन समयहरू 19,21 चाहिन्छ।vivo मा अवलोकन गरिएका αS युक्त कन्डेन्सेटहरू यो वा अन्य LLPS प्रक्रियाहरूद्वारा बनाइएका हुन् कि छैनन् भन्ने मुख्य अनसुलझे मुद्दा बनेको छ।त्यस्तै गरी, यद्यपि αS amyloid aggregation PD र अन्य synucleinopathies मा न्यूरोन्सहरूमा अवलोकन गरिएको छ, αS ले intracellular amyloid aggregation गुजर्ने सही संयन्त्र अस्पष्ट रहन्छ, किनकि यस प्रोटीनको ओभरएक्सप्रेसनले यो प्रक्रिया आफैंमा ट्रिगर गरेको देखिँदैन।अतिरिक्त सेलुलर क्षति प्रायः आवश्यक हुन्छ, सुझाव दिन्छ कि केहि सेलुलर स्थानहरू वा सूक्ष्म वातावरणहरू इन्ट्रासेलुलर αS एमाइलोइड एसेम्बलीहरूको पुनरुत्थानको लागि आवश्यक छ।एक सेलुलर वातावरण जुन विशेष गरी एकत्रीकरणको लागि प्रवण हुन्छ प्रोटीन कन्डेनसेट 23 को भित्री भाग हुन सक्छ।
चाखलाग्दो कुरा के छ भने, αS र tau लाई पार्किन्सन्स रोग र अन्य synucleinopathies 24,25 भएका मानिसहरूमा विशेषता रोग समावेशनमा सह-स्थानीयकरण भएको पाइयो र प्रयोगहरूले दुई प्रोटीनहरू 26,27 बीचको एक सम्भावित सम्बन्ध αS र neurodegenerative रोगहरु मा tau।बिरामी।αS र tau ले भिट्रो र vivo 28,29 मा एक-अर्काको एकत्रीकरणलाई अन्तरक्रिया र प्रवर्द्धन गर्न फेला पारेको छ र यी दुई प्रोटीनहरू मिलेर बनेको विषम समुच्चयहरू synucleinopathies 30 का बिरामीहरूको मस्तिष्कमा अवलोकन गरिएको छ।यद्यपि, αS र tau बीचको अन्तरक्रियाको आणविक आधार र यसको सह-एकत्रीकरणको संयन्त्रको बारेमा थोरै थाहा छ।αS ले αS को अत्यधिक नकारात्मक चार्ज भएको C-टर्मिनल क्षेत्र र Tau को केन्द्रीय प्रोलाइन-धनी क्षेत्र बीचको इलेक्ट्रोस्टेटिक आकर्षण मार्फत tau सँग अन्तरक्रिया गरेको रिपोर्ट गरिएको छ, जुन सकारात्मक चार्ज गरिएको अवशेषहरूमा पनि समृद्ध छ।
यस अध्ययनमा, हामी देखाउँछौं कि αS ले वास्तवमा ताउ प्रोटीनको उपस्थितिमा इलेक्ट्रोस्टेटिक जटिल संक्षेपण मार्फत थोपाहरूमा पृथक हुन सक्छ, यसको अन्य सकारात्मक चार्ज गरिएको पोलिपेप्टाइडहरू जस्तै पॉली-एल-लाइसिन (pLK) सँगको अन्तरक्रियाको विपरीत, र यस प्रक्रियामा।αS ले ड्रपलेट नेटवर्कको लागि स्क्याफोल्ड अणुको रूपमा कार्य गर्दछ।हामीले इलेक्ट्रोस्टेटिक αS coacervates को परिपक्वताको प्रक्रियामा उल्लेखनीय भिन्नताहरू पहिचान गरेका छौं, जुन कोसेर्भेट नेटवर्कमा संलग्न प्रोटीनहरूको अन्तरक्रियाको भ्यालेन्सी र शक्तिमा भिन्नताहरूसँग सम्बन्धित छ।चाखलाग्दो कुरा के छ भने, हामीले लामो समयसम्म चल्ने तरल कोसेर्भेटहरूमा αS र tau amyloid प्रोटीनहरूको सह-एकत्रीकरण अवलोकन गर्यौं र केही प्रमुख कारकहरू पहिचान गर्‍यौं जसले यी दुई प्रोटीनहरूको सह-एकत्रीकरणलाई त्यस्ता कोसेर्भेटहरूमा निम्त्याउँछ।यहाँ हामी यस प्रक्रियालाई विस्तृत रूपमा वर्णन गर्छौं, जुन रोग-विशिष्ट समावेशहरूमा दुई प्रोटीनहरूको स्थानीयकरण अन्तर्निहित सम्भावित आणविक संयन्त्र हो।
αS सँग तटस्थ pH (Fig. 1a) मा अत्यधिक anionic C-टर्मिनल पुच्छर छ, र हामीले यो परिकल्पना गर्यौं कि यसले polycationic disorded polypeptide molecules को साथ इलेक्ट्रोस्टेटिक कम्प्लेक्सको संक्षेपण मार्फत LLPS पार ​​गर्न सक्छ।हामीले प्रारम्भिक मोडेल अणुको रूपमा 100-अवशेष पोली-एल-लाइसिन (pLK) प्रयोग गर्यौं किनभने यसको सकारात्मक रूपमा चार्ज गरिएको र अव्यवस्थित पोलिमेरिक प्रकृति तटस्थ pH 32 मा छ। पहिले, हामीले pLK ले समाधान NMR स्पेक्ट्रोस्कोपी मार्फत αS को Ct डोमेनसँग अन्तर्क्रिया गर्छ भनेर पुष्टि गर्‍यौं। (चित्र 1b) 13C/15N-लेबल गरिएको αS प्रयोग गर्दै αS:pLK मोलर अनुपात बढेको उपस्थितिमा।αS को Ct-डोमेनसँग pLK को अन्तरक्रियाले रासायनिक परिवर्तन र प्रोटिनको यस क्षेत्रमा शिखर तीव्रतामा कमीको विचलनमा प्रकट हुन्छ।चाखलाग्दो कुरा के छ भने, जब हामीले αS लाई लगभग αS एकाग्रतामा pLK सँग मिसायौं।5–25 µM पोलिथिलीन ग्लाइकोल (5–15% PEG-8) को उपस्थितिमा (सामान्य LLPS बफर: 10 mM HEPES pH 7.4, 100 mM NaCl, 15% PEG-8) हामीले तुरुन्तै प्रोटीन गठनको विस्तृत क्षेत्रबाट गयौं। ।थोपाहरू प्रतिदीप्ति (WF) र उज्यालो-फिल्ड (BF) माइक्रोस्कोपी (चित्र 1c) प्रयोग गरेर अवलोकन गरियो।केन्द्रित αS (1 µM AlexaFluor488-लेबल गरिएको αS, AF488-αS थपिएको) भएको 1-5 µm थोपाहरू, तिनीहरूको इलेक्ट्रोस्ट्याटिक गुणहरू तिनीहरूको 10% 1,6-हेक्सानेडियोल (1,6-HD) र यसको संवेदनशीलताको प्रतिरोधबाट व्युत्पन्न गर्न सकिन्छ। NaCl एकाग्रतामा वृद्धि (चित्र 1c)।αS/pLK इलेक्ट्रोस्ट्याटिक कम्प्लेक्सको कोसेर्भेटहरूको तरल-जस्तो प्रकृति तिनीहरूको मिलिसेकेन्ड भित्र फ्यूज गर्ने क्षमताद्वारा प्रदर्शन गरिएको छ (चित्र 1d)।टर्बिडिमेट्री प्रयोग गरेर, हामीले यी सर्तहरू अन्तर्गत थोपाहरूको गठनको मात्रा निर्धारण गर्यौं, यसको स्थिरता (चित्र 1e) सँग सम्बन्धित मुख्य अन्तरक्रियाको इलेक्ट्रोस्टेटिक प्रकृति पुष्टि गर्‍यौं, र LLPS प्रक्रिया (चित्र 1f) मा विभिन्न बहुलक अनुपातहरूको प्रभावको मूल्याङ्कन गर्‍यौं।यद्यपि ड्रपलेट गठन बहुलक अनुपातको एक विस्तृत दायरामा अवलोकन गरिन्छ, प्रक्रिया धेरै अनुकूल हुन्छ जब pLK αS भन्दा बढी हुन्छ।एलएलपीहरू रासायनिक रूपमा फरक विस्थापन एजेन्ट dextran-70 (70 kDa) वा गिलास स्लाइड ड्रपहरू, विभिन्न सामग्रीहरूको माइक्रोप्लेट कुवाहरू, एपेनडोर्फ वा क्वार्ट्ज केशिकाहरू सहित विभिन्न नमूना ढाँचाहरू प्रयोग गरेर पनि अवलोकन गरिएको छ।
यस अध्ययनमा प्रयोग गरिएको WT-αS र ΔCt-αS भेरियन्टहरूमा विभिन्न प्रोटीन क्षेत्रहरूको योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व।एम्फिपाथिक एन-टर्मिनल डोमेन, हाइड्रोफोबिक एमाइलोइड-फर्मिङ (एनएसी) क्षेत्र, र नकारात्मक रूपमा चार्ज गरिएको सी-टर्मिनल डोमेन क्रमशः नीलो, सुन्तला र रातोमा देखाइएको छ।WT-αS को नेट चार्ज प्रति अवशिष्ट (NCPR) नक्सा देखाइएको छ।b macromolecular clumps को अनुपस्थिति मा αS/pLK अन्तरक्रिया को NMR विश्लेषण।pLK एकाग्रता बढ्दै जाँदा (αS:pLK मोलर अनुपात १:०.५, १:१.५, र १:१० क्रमशः हल्का हरियो, हरियो र गाढा हरियोमा देखाइन्छ)।c Coacervate αS/pLK (मोलर अनुपात 1:10) 25 µM मा (1 µM AF488-लेबल गरिएको αS वा Atto647N-लेबल गरिएको pLK WF इमेजिङको लागि) LLPS बफरमा (शीर्ष) वा 500 mMtobot सँग पूरक वा बायाँ (बायाँ) % 1,6-hexanediol (1,6-HD; तल दायाँ)।स्केल बार = 20 माइक्रोन।d 25 μM को एकाग्रतामा αS/pLK (मोलर अनुपात 1:10) को BF ड्रपलेट फ्यूजनको प्रतिनिधि माइक्रोस्कोपिक छविहरू;तीरहरूले व्यक्तिगत थोपाहरू (रातो र पहेंलो तीरहरू) लाई 200 ms भित्र नयाँ ड्रप (सुन्तला तीर) मा मर्ज भएको संकेत गर्दछ)।स्केल बार = 20 माइक्रोन।e लाइट स्क्याटरिङ (350 nm मा) 500 mM NaCl वा 10% 1,6-HD 25 µM αS मा जोड्नु अघि र पछि LLPS बफरमा αS/pLK एकत्रीकरण (N = 3 नमूना प्रतिकृतिहरू, औसत र मानक विचलन पनि संकेत गरिएको छ)।f BF छवि (शीर्ष) र 25 μM αS मा αS/pLK एकत्रीकरणको लाइट स्क्याटरिङ विश्लेषण (350 nm, तल) बढ्दो αS:pLK मोलर अनुपात (N = 3 नमूना प्रतिकृतिहरू, औसत र मानक विचलन पनि संकेत गरिएको छ)।स्केल बार = 10 µm।एउटा छविमा रहेको स्केल पट्टीले एउटा प्यानलमा भएका सबै छविहरूको स्केललाई सङ्केत गर्छ।कच्चा डाटा कच्चा डाटा फाइल को रूप मा प्रदान गरिएको छ।
αS/pLK इलेक्ट्रोस्टेटिक जटिल संक्षेपण र tau31 सँग प्रत्यक्ष अन्तरक्रिया मार्फत tau/RNA कन्डेन्सेटको क्लाइन्ट अणुको रूपमा αS को अघिल्लो अवलोकनहरूको आधारमा, हामीले परिकल्पना गर्यौं कि αS र tau RNA को अनुपस्थितिमा विलायकसँग सह-पृथक हुन सक्छ। संक्षेपण।इलेक्ट्रोस्टेटिक कम्प्लेक्सहरू मार्फत, र αS αS/Tau coacervates मा स्क्याफोल्ड प्रोटीन हो (चित्र 2e मा tau चार्ज वितरण हेर्नुहोस्)।हामीले अवलोकन गर्यौं कि जब 10 μM αS र 10 μM Tau441 (क्रमशः 1 μM AF488-αS र 1 μM Atto647N-Tau समावेश गरिएको) LLPS बफरमा सँगै मिसाइएको थियो, तिनीहरूले सजिलैसँग दुबै प्रोटीनहरू समावेश गरी प्रोटीन एग्रीगेटहरू गठन गरे, जस्तै WF माइक्रोकोपी द्वारा देखियो।(चित्र 2a)।थोपाहरूमा दुई प्रोटिनहरूको स्थानीयकरण कन्फोकल (CF) माइक्रोस्कोपी (पूरक चित्र 1a) द्वारा पुष्टि भयो।समान व्यवहार अवलोकन गरिएको थियो जब dextran-70 को एकीकरण एजेन्टको रूपमा प्रयोग गरिएको थियो (पूरक चित्र। 1c)।या त FITC-लेबल गरिएको PEG वा dextran प्रयोग गरेर, हामीले फेला पार्यौं कि दुबै क्राउडिङ एजेन्टहरू नमूनाहरूमा समान रूपमा वितरण गरिएको थियो, न त अलगाव न त एसोसिएसन देखाउँदै (पूरक चित्र 1d)।बरु, यसले सुझाव दिन्छ कि यस प्रणालीमा तिनीहरूले macromolecular क्राउडिङ प्रभावहरू मार्फत चरण विभाजनलाई बढावा दिन्छ, किनकि PEG एक प्राथमिकता स्थिर क्राउडिङ एजेन्ट हो, जस्तै अन्य LLP प्रणालीहरू 33,34 मा देखिन्छ।यी प्रोटिन युक्त थोपाहरू NaCl (1 M) को लागी संवेदनशील थिए तर 1,6-HD (10% v/v) लाई होइन, तिनीहरूको इलेक्ट्रोस्टेटिक गुणहरू पुष्टि गर्दै (पूरक चित्र 2a, b)।BF माइक्रोस्कोपी (चित्र 2b) को प्रयोग गरेर मिलिसेकेन्ड मर्जिङ ड्रपलेट घटनाहरू अवलोकन गरेर तिनीहरूको तरल व्यवहार पुष्टि भयो।
LLPS बफरमा αS/Tau441 को एक कन्फोकल (CF) माइक्रोस्कोपी छविहरू (प्रत्येक प्रोटीनको 10 μM, AF488-लेबल गरिएको αS र Atto647N-लेबल गरिएको Tau441 को 0.5 μM)।b αS/Tau441 ड्रपलेट फ्युजन घटनाहरूको प्रतिनिधि विभेदक हस्तक्षेप कन्ट्रास्ट (DIC) छविहरू (प्रत्येक प्रोटीनको लागि 10 μM)।c Tau441 LLPS (0–15 µM) को लाइट स्क्याटरिङ (350 nm मा) 50 µM αS को अनुपस्थिति (बायाँ) वा उपस्थिति (दायाँ) मा आधारित चरण रेखाचित्र।न्यानो रंगहरूले थप बिखर्ने संकेत गर्दछ।d बढ्दो αS एकाग्रताको साथ αS/Tau441 LLPS नमूनाहरूको हल्का बिखर्ने (Tau441 मा 5 µM, N = 2–3 नमूना पुनरावृत्तिहरू संकेत गरिएको रूपमा)।e यस अध्ययनमा प्रयोग गरिएका केही टाउ प्रोटीन भेरियन्टहरू र प्रोटीनका विभिन्न क्षेत्रहरूको योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व: नकारात्मक रूपमा चार्ज गरिएको एन-टर्मिनल डोमेन (रातो), प्रोलाइन-रिच क्षेत्र (नीलो), माइक्रोट्यूब्युल-बाइन्डिङ डोमेन (MTBD, सुन्तलामा हाइलाइट गरिएको), र amyloid-निर्माण जोडी सर्पिल।फिलामेन्ट क्षेत्रहरू (PHF) MTBD (ग्रे) भित्र अवस्थित छन्।Tau441 को नेट चार्ज प्रति अवशिष्ट (NCPR) नक्सा देखाइएको छ।f 1 µM AF488-लेबल गरिएको αS र Atto647N-लेबल गरिएको ΔNt- प्रयोग गर्दै, ΔNt-Tau (शीर्ष, 10 µM प्रति प्रोटीन) वा K18 (bottom प्रति प्रोटीन, 10 µM प्रति प्रोटीन) को उपस्थितिमा 1 µM AF488-लेबल गरिएको αS वा ΔCt-αS प्रयोग गर्दै। ) ) ) LLPS वा K18 बफरमा घनीभूत WF को माइक्रोग्राफ।एउटा छविमा भएका स्केल बारहरूले एउटा प्यानलमा भएका सबै छविहरूको स्केललाई प्रतिनिधित्व गर्दछ (प्यानल a, b र f का लागि 20 µm)।प्यानल c र d को लागि कच्चा डाटा कच्चा डाटा फाइल को रूप मा प्रदान गरिन्छ।
यस LLPS प्रक्रियामा αS को भूमिका परीक्षण गर्न, हामीले पहिलो पटक NaCl (चित्र 2c) को बढ्दो सांद्रता प्रयोग गरेर नेफेलोमेट्री द्वारा ड्रपलेट स्थिरतामा αS को प्रभावको अनुसन्धान गर्यौं।αS युक्त नमूनाहरूमा नुन एकाग्रता जति उच्च हुन्छ, प्रकाश स्क्याटरिङ मानहरू (350 nm मा) उच्च हुन्छ, जसले यस LLPS प्रणालीमा αS को स्थिर भूमिकालाई संकेत गर्छ।समान प्रभाव αS एकाग्रता (र त्यसैले αS: Tau441 अनुपात) लगभग बढाएर अवलोकन गर्न सकिन्छ।Tau एकाग्रता (5 µM) (चित्र 2d) को सापेक्ष 10-गुना वृद्धि।αS coacervates मा एक स्क्याफोल्ड प्रोटीन हो भनेर देखाउन, हामीले LLPS-अवरोधित Tau mutant को व्यवहारको अनुसन्धान गर्ने निर्णय गर्यौं, जसमा ΔNt-Tau भनिने N-टर्मिनल क्षेत्र (अवशेषहरू 1-150, हेर्नुहोस्। 2e) को अभाव छ।WF माइक्रोस्कोपी र नेफेलोमेट्रीले पुष्टि गर्‍यो कि ΔNt-Tau आफैंले LLPS (चित्र 2f र पूरक चित्र 2d) गुजरेको छैन, जसरी पहिले रिपोर्ट गरिएको थियो 14। यद्यपि, जब αS यस काटिएको Tau संस्करणको फैलावट समाधानहरूमा थपियो, LLPS प्रक्रिया पूर्ण रूपमा थियो। समान अवस्था र प्रोटीन सांद्रता अन्तर्गत Tau र αS को पूर्ण-आकार समाधानहरूको ड्रपलेट घनत्वको नजिक ड्रपलेट घनत्व संग पुनर्स्थापित।यो प्रक्रिया कम macromolecular क्राउडिङ (पूरक चित्र 2c) को अवस्थामा पनि अवलोकन गर्न सकिन्छ।C-टर्मिनल αS क्षेत्रको भूमिका, तर यसको सम्पूर्ण लम्बाइ होइन, LLPS प्रक्रियामा C-टर्मिनल काटिएको αS संस्करणको अवशेषहरू 104-140 (चित्र 1a) को प्रयोग गरेर ड्रपलेट गठनको अवरोधद्वारा प्रदर्शन गरिएको थियो (ΔCt- αS) प्रोटीन (चित्र 2f र पूरक चित्र 2d)।αS र ΔNt-Tau को स्थानीयकरण कन्फोकल फ्लोरोसेन्स माइक्रोस्कोपी द्वारा पुष्टि गरिएको थियो (पूरक चित्र। 1b)।
Tau441 र αS बीचको LLPS मेकानिजमलाई थप परीक्षण गर्न, थप Tau संस्करण प्रयोग गरिएको थियो, अर्थात् माइक्रोट्युब्युल-बाइन्डिङ डोमेन (MTBD) मा जोडी हेलिकल फिलामेन्ट कोर (PHF) खण्ड, जसमा चार विशेषता दोहोरिने डोमेनहरू छन् भने, सामान्यतया पनि चिनिन्छ। K18 टुक्राको रूपमा (चित्र 2e हेर्नुहोस्)।यो भर्खरै रिपोर्ट गरिएको छ कि αS प्राथमिकतामा एक प्रोलाइन-रिच डोमेनमा अवस्थित टाउ प्रोटीनसँग जोडिएको छ जुन अनुक्रममा माइक्रोट्यूब्युल-बाइन्डिंग डोमेनको अगाडि हुन्छ।यद्यपि, PHF क्षेत्र पनि सकारात्मक रूपमा चार्ज गरिएको अवशेषहरू (चित्र 2e हेर्नुहोस्), विशेष गरी लाइसिन (15% अवशेषहरू) मा धनी छ, जसले हामीलाई यो क्षेत्रले αS/Tau परिसरको संक्षेपणमा योगदान पुर्‍याउँछ कि भनेर परीक्षण गर्न प्रेरित गर्‍यो।हामीले निरीक्षण गरेका छौं कि K18 एक्लैले परीक्षण गरिएका सर्तहरू अन्तर्गत 100 μM सम्म सांद्रतामा LLPS ट्रिगर गर्न सक्दैन (15% PEG वा 20% dextran सँग LLPS बफर) (चित्र 2f)।यद्यपि, जब हामीले 50 µM αS लाई 50 µM K18 मा थप्यौं, K18 र αS भएका प्रोटीन थोपाहरूको द्रुत गठन नेफेलोमेट्री (पूरक चित्र 2d) र WF माइक्रोस्कोपी (चित्र 2f) द्वारा अवलोकन गरियो।अपेक्षित रूपमा, ΔCt-αS K18 (चित्र 2f) को LLPS व्यवहार पुनर्स्थापित गर्न असमर्थ थियो।हामी नोट गर्छौं कि αS/ΔNt-Tau वा αS/Tau441 को तुलनामा αS/K18 एकत्रीकरणलाई LLPS उत्प्रेरित गर्न थोरै उच्च प्रोटीन सांद्रता चाहिन्छ, अन्य चीजहरू बराबर छन्।यो माइक्रोट्युब्युल-बाइन्डिङ डोमेनको तुलनामा प्रोलाइन-रिच टाउ डोमेनको साथ αS C-टर्मिनल क्षेत्रको बलियो अन्तरक्रियासँग अनुरूप छ, जसरी पहिले वर्णन गरिएको थियो 31।
ΔNt-Tau ले αS को अनुपस्थितिमा LLPS प्रदर्शन गर्न सक्दैन भन्ने कुरालाई ध्यानमा राख्दै, हामीले αS/Tau LLPS लाई पूर्ण-लम्बाइ Tau (isotype, Tau441/Tau441) सँग LLPS प्रणालीहरूमा यसको सरलता दिएर αS/Tau LLPS लाई चित्रण गर्ने मोडेलको रूपमा यो Tau संस्करण रोज्यौं।जटिल (हेटेरोटाइपिक, αS/Tau441) एकत्रीकरण प्रक्रियाहरूसँग।हामीले αS/Tau र αS/ΔNt-Tau प्रणालीहरूमा सेन्ट्रीफ्युगेशन र फैलिएको चरण SDS-PAGE विश्लेषण (हेर्नुहोस् 2e) मा αS एकत्रीकरणको डिग्री (कन्डेन्स्ड चरण प्रोटीन, fαS,c को भागको रूपमा) तुलना गर्‍यौं, धेरै समान मानहरू फेला पर्‍यो। एउटै एकाग्रतामा सबै प्रोटीनहरूको लागि।विशेष गरी, हामीले αS/Tau र αS/ΔNt-Tau को लागि क्रमशः fαS,c 84 ± 2% र 79 ± 7% प्राप्त गर्यौं, सुझाव दिँदै αS र tau बीचको heterotypic अन्तरक्रिया tau अणुहरू बीचको अन्तरक्रिया भन्दा उच्च छ।बीचमा।
विभिन्न पोलिकेसनहरूसँगको अन्तरक्रिया र αS काइनेटिक्समा संक्षेपण प्रक्रियाको प्रभावलाई पहिलो पटक फोटोब्लिचिङ (FRAP) विधि पछि फ्लोरोसेन्स रिकभरीद्वारा अध्ययन गरिएको थियो।हामीले αS/Tau441, αS/ΔNt-Tau र αS/pLK coacervates (100 μM αS 2 μM αS AF488-αS र 100 μM Tau441 वा ΔNt-Tau वा 1 mM pLK सँग पूरक) परीक्षण गर्‍यौं।नमूना अवयवहरू मिश्रण गरेपछि पहिलो 30 मिनेट भित्र डेटा प्राप्त गरियो।प्रतिनिधि FRAP छविहरू (Fig. 3a, αS/Tau441 संक्षेपण) र तिनीहरूको सम्बन्धित समय पाठ्यक्रम वक्रहरू (चित्र। 3b, पूरक चित्र। 3), यो देख्न सकिन्छ कि αS गतिविज्ञानहरू Tau441 coacervates सँग धेरै मिल्दोजुल्दो छन्।र ΔNt-Tau, जुन pLK सँग धेरै छिटो छ।FRAP (Kang et al. 35 द्वारा वर्णन गरिए अनुसार) coacervate भित्र αS को लागि गणना गरिएको प्रसार गुणांकहरू D = 0.013 ± 0.009 µm2/s र D = 0.026 ± 0.008 µm2/s αS/TauΔS/Tau4 को लागि αS/ प्रणाली।pLK, Tau, र D = 0.18 ± 0.04 µm2/s, क्रमशः (चित्र 3c)।यद्यपि, फैलिएको चरणमा फैलावट गुणांक αS सबै सघन चरणहरू भन्दा धेरै परिमाणका अर्डरहरू छन्, जस्तै फ्लोरोसेन्स सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी (FCS, पूरक चित्र 3 हेर्नुहोस्) समान अवस्थाहरूमा (LLPS बफर) तर polycations को अनुपस्थितिमा। (D = 8 ± 4 µm2/s)।तसर्थ, αS अनुवादको गतिविज्ञान स्पष्ट आणविक क्राउडिंग प्रभावहरूको कारणले फैलिएको चरणमा प्रोटीनहरूको तुलनामा coacervates मा उल्लेखनीय रूपमा कम हुन्छ, यद्यपि सबै coacervates ले तरल-जस्तो गुणहरू तिनीहरूको गठन पछि पहिलो आधा घण्टामा राख्छन्, टाउ चरणको विपरीत।pLK कन्डेनसेटमा छिटो गतिविज्ञान।
इलेक्ट्रोस्टेटिक कोसेर्भेट्समा αS गतिशीलता (2% AF488-लेबल गरिएको αS) को a–c FRAP विश्लेषण।αS/Tau441 FRAP assays को ट्रिप्लिकेटमा प्रतिनिधि छविहरू (a) मा देखाइएको छ, जहाँ रातो सर्कलहरूले रंगीन क्षेत्रहरू संकेत गर्दछ।स्केल बार 5 µm छ।b औसत FRAP वक्रहरू र (c) गणना गरिएको प्रसार गुणांक (D) 5-6 (N) का लागि तीनवटा प्रयोगहरूबाट 100 µM αS र Tau441 (रातो) वा ΔNt-Tau (नीलो) वा pLK (हरियो) को समतुल्य सांद्रताहरू प्रयोग गरेर विभिन्न थोपाहरू। LLPS को दस गुणा एकाग्रतामा।FRAP वक्र को मानक विचलन छायादार रंग मा देखाइएको छ।तुलनाको लागि, फैलिएको चरणमा प्रसार गुणांक αS फ्लोरोसेन्स सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी (FCS) प्रयोग गरेर ट्रिपलिकेटमा निर्धारण गरिएको थियो (थप जानकारीको लागि पूरक चित्र 3 र विधिहरू हेर्नुहोस्)।d LLPS बफरमा 100 μM TEMPOL-122-αS को निरन्तर X-ब्यान्ड ईपीआर स्पेक्ट्रा बिना कुनै पोलिकेशन (कालो) वा 100 μM Tau441 (रातो) वा ΔNt-Tau (नीलो) वा 1 mM pLK (हरियो) को उपस्थितिमा।इनसेटले बलियो क्षेत्र रेखाहरूको म्याग्निफाइड दृश्य देखाउँछ जहाँ सबैभन्दा नाटकीय परिवर्तनहरू हुन्छन्।e 50 μM TEMPOL-122-αS को बाइन्डिङ कर्भहरू LLPS को अनुपस्थितिमा बिभिन्न पोलिकेसनहरूसँग (कुनै PEG)।सामान्यीकृत EPR स्पेक्ट्रमको ब्यान्ड II (IIII/III) को तुलनामा ब्यान्ड III को घटाइएको आयाम Tau441 (रातो), ΔNt-Tau (नीलो) र pLK (हरियो) को मोलर अनुपात बढाउन देखाइएको छ।रंगीन रेखाहरूले प्रत्येक वक्रमा n समान र स्वतन्त्र बाइन्डिङ साइटहरू भएको रफ बाइन्डिङ मोडेल प्रयोग गरेर डेटामा फिट देखाउँछन्।कच्चा डाटा कच्चा डाटा फाइल को रूप मा प्रदान गरिन्छ।
एक पूरकको रूपमा, हामीले निर्देशित स्पिन लेबलिङ (SDSL) र निरन्तर इलेक्ट्रोन प्यारामैग्नेटिक रेजोनान्स (CW-EPR) प्रयोग गरेर विभिन्न coacervates मा αS को गतिशीलताको अनुसन्धान गर्यौं।यो विधि एक यथार्थवादी अवशिष्ट रिजोल्युसन 36,37,38 संग IDP को लचिलोपन र गतिशीलता रिपोर्ट गर्न धेरै उपयोगी साबित भएको छ।यसका लागि, हामीले एकल Cys म्युटेन्टहरूमा सिस्टिन अवशेषहरू निर्माण गर्यौं र 4-hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidine-N-oxyl (TEMPOL) स्पिन प्रोब प्रयोग गर्यौं।Maleimide डेरिभेटिभहरूले तिनीहरूलाई लेबल गर्दछ।थप विशेष रूपमा, हामीले TEMPOL प्रोबहरू 122 वा 24 αS (TEMPOL-122-αS र TEMPOL-24-αS) मा सम्मिलित गर्यौं।पहिलो अवस्थामा, हामी प्रोटीनको सी-टर्मिनल क्षेत्रलाई लक्षित गर्छौं, जुन पोलिकेसनहरूसँग अन्तरक्रियामा संलग्न छ।यसको सट्टा, स्थिति 24 ले हामीलाई कन्डेनसेटमा प्रोटीनहरूको समग्र गतिशीलताको बारेमा जानकारी दिन सक्छ।दुबै अवस्थामा, फैलिएको चरणको प्रोटीनहरूको लागि प्राप्त EPR संकेतहरू द्रुत गतिमा चलिरहेको अवस्थामा नाइट्रोक्साइड रेडिकलहरूसँग मेल खान्छ।tau वा pLK (100 μM TEMPOL-αS, Tau441 वा ΔNt-Tau 1:1 को अनुपातमा वा pLK 1:10 को अनुपातमा) को उपस्थितिमा चरण विभाजन पछि, सापेक्ष शिखर तीव्रतामा वृद्धि देखियो। αS को EPR स्पेक्ट्रम।घाटा रेखा फराकिलो भयो, पातलो चरणमा प्रोटीनको तुलनामा थोपाहरूमा αS पुन: अभिविन्यास गतिविज्ञान घटेको संकेत गर्दछ (चित्र 3d, पूरक चित्र। 4a)।यी परिवर्तनहरू स्थिति 122 मा अधिक स्पष्ट छन्। जबकि स्थिति 24 मा pLK को उपस्थितिले प्रोबको गतिविज्ञानलाई असर गर्दैन, स्थिति 122 मा स्पेक्ट्रल रेखा आकार महत्त्वपूर्ण रूपमा परिवर्तन भयो (पूरक चित्र। 4a)।जब हामीले स्पिन-लेबल गरिएको IDP38,39 को गतिशीलता वर्णन गर्न प्रयोग गरिने आइसोट्रोपिक मोडेल (पूरक चित्र 5a) को प्रयोग गरेर दुई αS/polycation प्रणालीहरूको स्थिति 122 मा स्पेक्ट्रा मोडेल गर्ने प्रयास गर्दा, हामी प्रयोगात्मक स्पेक्ट्रा पुनर्निर्माण गर्न असमर्थ थियौं।।24 स्पिन कन्ट्रास्टको स्थितिको स्पेक्ट्रल सिमुलेशन (पूरक चित्र 5a)।यसले सुझाव दिन्छ कि αS को C-टर्मिनल क्षेत्रको स्पिन कन्फिगरेसनको स्पेसमा पोलिकेसनको उपस्थितिमा अधिमान्य स्थानहरू छन्।प्रयोगात्मक EPR सर्तहरू अन्तर्गत संकुचित चरणमा αS को अंशलाई विचार गर्दा (αS/Tau441, αS/ΔNt-Tau, र αS/pLK को लागि 84 ± 2%, 79 ± 7%, र 47 ± 4% क्रमशः- पूरक हेर्नुहोस्। Fig. डेटा विश्लेषण c को 2e), यो देख्न सकिन्छ कि EPR विधि द्वारा पत्ता लगाइएको फराकिलोले मुख्यतया αS को C-टर्मिनल क्षेत्रको अन्तरक्रियालाई प्रतिबिम्बित गर्दछ विभिन्न polycations संग संकुचित चरण (TEMPOL-122 प्रयोग गर्दा मुख्य परिवर्तन। αS), र प्रोटीन संक्षेपण होइन।अनुसन्धानमा माइक्रोभिस्कोसिटीमा वृद्धि देखिएको छ।अपेक्षित रूपमा, LLPS बाहेक अन्य अवस्थाहरूमा प्रोटीनको EPR स्पेक्ट्रम पूर्ण रूपमा पुनर्स्थापित भयो जब मिश्रणमा 1 M NaCl थपियो (पूरक चित्र 4b)।समग्रमा, हाम्रो डेटाले सुझाव दिन्छ कि CW-EPR द्वारा पत्ता लगाइएका परिवर्तनहरूले मुख्यतया αS को C-टर्मिनल क्षेत्रको अन्तरक्रियालाई प्रतिबिम्बित गर्दछ विभिन्न polycations संग गाढा चरणमा, र यो अन्तरक्रिया Tau संग भन्दा pLK संग बलियो देखिन्छ।
Coacervate मा प्रोटीन को बारे मा अधिक संरचनात्मक जानकारी प्राप्त गर्न को लागी, हामीले समाधान मा NMR प्रयोग गरेर LLPS प्रणाली को अध्ययन गर्ने निर्णय गर्यौं।यद्यपि, हामीले फैलिएको चरणमा बाँकी रहेको αS अंश मात्र पत्ता लगाउन सक्छौं, जुन कोसेर्भेट भित्र कम प्रोटीन गतिशीलता र NMR विश्लेषणमा समाधानको फेदमा घने चरणको कारण हुन सक्छ।जब हामीले NMR (पूरक चित्र 5c, d) को प्रयोग गरेर LLPS नमूनाको फैलिएको चरणमा बाँकी रहेको प्रोटिनको संरचना र गतिशीलताको विश्लेषण गर्यौं, हामीले देख्यौं कि प्रोटिनले pLK र ΔNt-Tau को उपस्थितिमा लगभग उस्तै व्यवहार गरेको देख्यौं। जो प्रोटीन ब्याकबोनको माध्यमिक संरचना र गतिशीलतामा थिए, माध्यमिक रासायनिक शिफ्ट र R1ρ विश्राममा प्रयोगहरूद्वारा प्रकट भयो।एनएमआर डेटाले देखाउँछ कि αS को सी-टर्मिनसले यसको अव्यवस्थित प्रकृतिलाई कायम राख्दै संरचनात्मक लचिलोपनको महत्त्वपूर्ण हानि भोग्छ, बाँकी प्रोटीन अनुक्रम जस्तै, यसको पोलिकेसनहरूसँगको अन्तरक्रियाको कारण।
TEMPOL-122-αS कन्डेन्स्ड चरणमा अवलोकन गरिएको CW-EPR संकेत विस्तारले पोलिकेशनसँग प्रोटीनको अन्तरक्रियालाई प्रतिबिम्बित गर्दछ, हामीले LLPS को अनुपस्थितिमा विभिन्न पोलिकेशनहरूमा αS को बाध्यकारी आत्मीयता मूल्याङ्कन गर्न EPR टाइट्रेसन प्रदर्शन गर्‍यौं (कुनै सङ्कलन छैन। बफर LLPS), सुझाव दिँदै कि अन्तरक्रियाहरू पातलो र केन्द्रित चरणहरूमा समान छन् (जसलाई हाम्रो डेटा, पूरक चित्र 4a र पूरक चित्र 6 द्वारा पुष्टि गरिएको छ)।लक्ष्य भनेको सबै coacervates, तिनीहरूको सामान्य तरल पदार्थ-जस्तो गुणहरूको बावजुद, आणविक स्तरमा कुनै पनि अन्तर्निहित भिन्न व्यवहार प्रदर्शन गर्दछ कि भनेर हेर्नु थियो।अपेक्षित रूपमा, EPR स्पेक्ट्रम बढ्दो polycation एकाग्रता संग फराकिलो, लगभग संतृप्ति (चित्र 3e, पूरक Fig. 6) को सबै अन्तरक्रिया साझेदारहरु को आणविक अन्तरक्रिया को कारण आणविक लचिलोपन मा कमी को प्रतिबिम्बित।pLK ले ΔNt-Tau र Tau441 को तुलनामा कम मोलर अनुपात (polycation:αS) मा यो संतृप्ति हासिल गर्यो।वास्तवमा, n समान र स्वतन्त्र बाइन्डिङ साइटहरू मान्ने अनुमानित बाध्यकारी मोडेलसँग डेटाको तुलनाले देखायो कि pLK (~ 5 μM) को स्पष्ट पृथक्करण स्थिरता Tau441 वा ΔNt-Tau (~ 50 μM) भन्दा कम परिमाणको अर्डर हो। )।µM)।यद्यपि यो कुनै नराम्रो अनुमान हो, यसले सुझाव दिन्छ कि αS सँग निरन्तर सकारात्मक चार्ज क्षेत्रहरूसँग सरल पोलिकेसनहरूको लागि उच्च आत्मीयता छ।αS र विभिन्न polycations बीचको सम्बन्धमा यो भिन्नतालाई ध्यानमा राख्दै, हामीले परिकल्पना गर्यौं कि तिनीहरूको तरल गुणहरू समयसँगै फरक फरक हुन सक्छ र यसैले विभिन्न LSPT प्रक्रियाहरूबाट पीडित हुन्छ।
प्रोटीन कोसेर्भेट भित्र अत्यधिक भीड वातावरण र प्रोटीनको एमाइलोइड प्रकृतिलाई ध्यानमा राख्दै, हामीले सम्भावित LSPT प्रक्रियाहरू पत्ता लगाउन समयसँगै कोसरभेटको व्यवहार देख्यौं।BF र CF माइक्रोस्कोपी (चित्र 4) को प्रयोग गरेर, हामीले अवलोकन गर्‍यौं कि αS/Tau441 ले समाधानमा ठूलो हदसम्म कोसेर्भेट गर्छ, ठूला थोपाहरू बनाउँछ जसले इनार/स्लाइडको तलको सतहलाई सम्पर्क गरी भिजाउँछ, अपेक्षित रूपमा (पूरक चित्र। 7d);हामी यी तल्लो-गठित संरचनाहरूलाई "प्रोटिन राफ्ट्स" भन्छौं।यी संरचनाहरू तरल रहे किनभने तिनीहरूले फ्यूज गर्ने क्षमता राखे (पूरक चित्र 7b) र LLPS ट्रिगर भएपछि धेरै घण्टासम्म देख्न सकिन्छ (चित्र 4 र पूरक चित्र 7c)।हामीले अवलोकन गर्यौं कि हाइड्रोफोबिक सामग्रीहरू (पूरक चित्र 7a) भन्दा हाइड्रोफिलिकको सतहमा भिजाउने प्रक्रिया मनपर्छ, असंतुलित चार्जहरू र यसरी उच्च इलेक्ट्रोस्ट्याटिक सतह क्षमताहरू भएका इलेक्ट्रोस्ट्याटिक कोसेर्भेटहरूका लागि अपेक्षित रूपमा।उल्लेखनीय रूपमा, αS/ΔNt-Tau coalescence र rafting उल्लेखनीय रूपमा घटाइएको थियो, जबकि αS/pLK कन्डेनसेटहरू उल्लेखनीय रूपमा कम भएका थिए (चित्र 4)।छोटो इन्क्युबेशन समयको दौडान, αS/pLK थोपाहरू मिलाएर हाइड्रोफिलिक सतहलाई भिजाउन सक्षम थिए, तर यो प्रक्रिया छिट्टै रोकियो र इन्क्युबेशनको 5 घण्टा पछि, मात्र सीमित संगठित घटनाहरू र कुनै भिजेको अवलोकन गरिएको थिएन।- जेल ड्रिप संक्रमण।
प्रतिनिधि BF (ग्रेस्केल प्यानलहरू) र CF (दायाँ प्यानलहरू, AF488-लेबल गरिएको αS हरियोमा) LLPS बफरमा 100 µM αS (1% फ्लोरोसेन्ट लेबल) सहितको कोसेर्भेट नमूनाहरू 100 µM माइक्रो टपको उपस्थितिमा (Tau41pc) छवि - Tau (केन्द्र) वा 1 mM pLK (तल) विभिन्न इन्क्युबेशन समय र फोकल हाइट्स (z, प्लेटको तलबाट राम्रो दूरी)।प्रयोगहरू समान परिणामहरूको साथ एकअर्काबाट स्वतन्त्र रूपमा 4-6 पटक दोहोर्याइएको थियो।αS/Tau441 coacervates 24 घण्टा पछि भिजेको छ, छवि भन्दा ठूलो राफ्टहरू बनाउँछ।सबै छविहरूको लागि स्केल बार 20 μm हो।
हामीले त्यसपछि सोध्यौं कि αS/Tau441 LLPS मा बनाइएका ठूला तरल पदार्थ-जस्तो प्रोटीन पूलहरूले अध्ययन गरिएको कुनै पनि प्रोटीनको एमाइलोइड एकत्रीकरणको नेतृत्व गर्नेछ।हामीले माथिको जस्तै अवस्थाहरूमा WF माइक्रोस्कोपीको साथ समयको साथमा αS/Tau441 ड्रपलेटहरूको परिपक्वता अनुसरण गर्‍यौं, तर 1 μM AF488-लेबल गरिएको αS र Atto647N-लेबल Tau441 (चित्र 5a) प्रयोग गरेर।अपेक्षित रूपमा, हामीले परिपक्वता प्रक्रियामा पूर्ण प्रोटीन स्थानीयकरण अवलोकन गर्यौं।चाखलाग्दो कुरा, ca बाट।५ घन्टा पछि, राफ्ट भित्र थप गहन गैर-वृत्ताकार संरचनाहरू देखिए, जसलाई हामीले "पोइन्टहरू" भन्यौं, जसमध्ये केहीलाई αS द्वारा स्थानीयकरण गरिएको थियो, र केही Tau441 (चित्र 5a, सेतो तीर) मा समृद्ध थिए।यी स्पटहरू αS/ΔNt-Tau को तुलनामा αS/ΔNt-Tau को लागि धेरै हदसम्म राफ्ट्स भित्र अवलोकन गरिएको छ।pLK र Tau प्रणालीका थोपाहरूमा फ्युजन/भिजाउनको लागि असक्षमतामा कुनै फरक दागहरू थिएनन्।αS र Tau441 समावेश भएका यी दागहरू amyloid-जस्तै समुच्चयहरू हुन् कि छैनन् भनी परीक्षण गर्न, हामीले CF माइक्रोस्कोपी प्रयोग गरेर समान प्रयोग गर्यौं जसमा Tau441 Atto647N सँग लेबल गरिएको थियो र 12.5 μM amyloid-विशिष्ट thioflavin-T (ThT) सुरुबाट थपिएको थियो।रङ्ग।यद्यपि αS/Tau441 थोपा वा rafts को ThT-स्टेनिङ 24 घन्टा इन्क्युबेशन पछि पनि अवलोकन गरिएको थिएन (चित्र 5b, शीर्ष पङ्क्ति - प्रोटीन राफ्टहरूमा बाँकी थोपा), राफ्ट भित्र Atto647N-Tau441 समावेश भएको ThT-सकारात्मक संरचनाहरू धेरै कमजोर थिए।यसले पहिले वर्णन गरिएका दागहरूको आकार, आकार र स्थान (चित्र 5b, मध्य र तल्लो पङ्क्तिहरू) लाई नक्कल गर्छ, जसले दागहरू एमाइलोइड-जस्तै एग्रीगेट्ससँग मिल्दोजुल्दो हुनसक्छ भन्ने सुझाव दिन्छ।
WF 25 μM αS विभिन्न इन्क्युबेशन समय र फोकल हाइट्स (z, अनबाउन्ड तलबाट दूरी) 25 μM Tau441 (1 μM AF488-लेबल गरिएको αS र Atto647N-लेबल गरिएको Tau441) को उपस्थितिमा LLPS buffer सँग माइक्रोस्कोप प्लेटको इनारमा) ।छवटा प्रयोगहरू समान परिणामहरूको साथ स्वतन्त्र रूपमा दोहोर्याइएको थियो।25 μM Tau441 (1 μM Atto647N-लेबल Tau441) र 12.5 μM thioflavin-T (ThT) को उपस्थितिमा 25 μM αS को सीएफ माइक्रोस्कोपिक छवि।भारित प्रोटीन थोपाहरू र जम्मा गरिएका प्रोटीन राफ्टहरू र स्पटहरू क्रमशः शीर्ष र मध्य पङ्क्तिहरूमा देखाइएका छन्।तलको पङ्क्तिले 3 स्वतन्त्र प्रतिकृतिहरूबाट राफ्ट र ड्रपहरूको छविहरू देखाउँछ।सेतो तीरहरूले दुबै प्यानलहरूमा ThT-सकारात्मक बिन्दुहरू संकेत गर्दछ।सबै छविहरूको लागि स्केल बार 20 μm हो।
तरलबाट ठोसमा ट्रान्जिसनको क्रममा कोसेर्भेट प्रोटीन नेटवर्कमा भएका परिवर्तनहरू थप विवरणमा जाँच गर्न, हामीले फ्लोरोसेन्स लाइफटाइम इमेजिङ (FLIM) र Förster रेजोनान्स एनर्जी ट्रान्सफर माइक्रोस्कोपी (FRET) (चित्र 6 र पूरक फिगरहरू 8 र 9) प्रयोग गर्यौं।हामीले परिकल्पना गर्‍यौं कि तहको कोसेर्भेट परिपक्वतालाई थप संकुचित वा ठोस-जस्तो समग्र प्रोटीन संरचनामा प्रोटिन र यसमा संलग्न फ्लोरोसेन्ट प्रोब बीचको नजिकको सम्पर्कमा जान्छ, सम्भावित रूपमा छोटो प्रोब लाइफटाइम (τ) मा प्रकट भएको शमन प्रभाव उत्पादन गर्दछ। , पहिले वर्णन गरिए अनुसार 40।४१,४२।थप रूपमा, डबल लेबल गरिएका नमूनाहरूका लागि (AF488 र Atto647N क्रमशः FRET डोनर र स्वीकर्ता रंगहरूका रूपमा), τ मा यो कमी पनि LSPT को समयमा coacervate संक्षेपण र FRET(E) दक्षतामा वृद्धिको साथ हुन सक्छ।हामीले LLPS αS/Tau441 र αS/ΔNt-Tau नमूनाहरू (LLPS बफरमा प्रत्येक प्रोटीनको 25 µM 1 µM AF488 लेबल αS र/वा Atto647N लेबल गरिएको Tau441 वा ΔNt-Tau) मा समयसँगै राफ्ट र स्पट गठनको अनुगमन गर्यौं।हामीले सामान्य प्रवृति देख्यौं कि AF488 (τ488) र Atto647N (τ647N) प्रोबहरूको प्रतिदीप्ति जीवनकाल कोसेर्भेटहरू परिपक्व भएपछि थोरै घट्यो (चित्र 6 र पूरक चित्र। 8c)।चाखलाग्दो कुरा के छ भने, यस परिवर्तनलाई राफ्ट्स (चित्र 6c) भित्रका थोप्लाहरूका लागि उल्लेखनीय रूपमा बढाइएको थियो, जसले थोप्लाहरूमा थप प्रोटीन संक्षेपण भएको देखाउँछ।यसको समर्थनमा, 24 घन्टा (पूरक चित्र 8d) को उमेरका αS/ΔNt-Tau ड्रपलेटहरूका लागि प्रतिदीप्ति जीवनकालमा कुनै महत्त्वपूर्ण परिवर्तन देखिएन, सुझाव दिन्छ कि ड्रपलेट गेलेसन स्पटिङ भन्दा फरक प्रक्रिया हो र यो महत्त्वपूर्ण आणविक पुनर्गठन संग छैन। coacervates भित्र।यो ध्यान दिनु पर्छ कि बिन्दुहरू αS मा फरक आकार र चर सामग्री छन्, विशेष गरी αS/Tau441 प्रणालीको लागि (पूरक चित्र। 8e)।स्पट फ्लोरोसेन्स जीवनकालमा कमी तीव्रतामा वृद्धिको साथमा थियो, विशेष गरी Atto647N लेबल गरिएको Tau441 (पूरक चित्र 8a), र उच्च FRET दक्षता दुवै αS/Tau441 र αS/ΔNt-Tau प्रणालीहरूको लागि, थप संक्षेपणमा पाँच घण्टा संकेत गर्दै। ट्रिगर गरेपछि, स्थिर बिजुली भित्रको प्रोटिनहरू गाढा हुन्छ।αS/ΔNt-Tau को तुलनामा, हामीले αS/Tau441 स्पटहरूमा तल्लो τ647N र केही हदसम्म उच्च τ488 मानहरू देख्यौं, कम र अधिक असंगत FRET मानहरूको साथ।सम्भवतः, यो तथ्यसँग सम्बन्धित हुन सक्छ कि αS/Tau441 प्रणालीमा, अवलोकन र अपेक्षित αS प्रचुरता समुच्चयमा अधिक विषम हुन्छ, प्रायः ताउको तुलनामा सबस्टोइचियोमेट्रिक हुन्छ, किनकि Tau441 ले पनि LLPS र एकत्रीकरणबाट गुज्रन सक्छ (पूरक चित्र 8e) ।यद्यपि, ड्रपलेट कोलेसेन्सको डिग्री, राफ्ट गठन, र, महत्त्वपूर्ण रूपमा, तरल-जस्तै कोसेर्भेट्स भित्र प्रोटीन एकत्रीकरण अधिकतम हुन्छ जब दुबै Tau441 र αS उपस्थित हुन्छन्।
प्रत्येक प्रोटीनको 25 μM मा αS/Tau441 र αS/ΔNt-Tau को लाइफटाइम फ्लोरोसेन्स माइक्रोस्कोपी (FLIM) छविहरू (1 μM AF488-लेबल गरिएको αS र 1 μM Atto647N-लेबल गरिएको Tau441 वा ΔNt-Tau LLPS buff) मा।स्तम्भहरूले विभिन्न परिपक्वता समयमा LLPS नमूनाहरूको प्रतिनिधि छविहरू देखाउँछन् (30 मिनेट, 5 घन्टा र 24 घन्टा)।रातो फ्रेमले αS/Tau441 स्पटहरू भएको क्षेत्र देखाउँछ।लाइफ स्प्यान्स रङ बारको रूपमा देखाइन्छ।स्केल बार = 20 µm सबै छविहरूको लागि।b चयन गरिएको क्षेत्रको FLIM छवि जुम-इन गर्नुहोस्, प्यानल ए मा रातो बक्समा देखाइएको छ।जीवन दायराहरू प्यानल ए मा जस्तै रङ स्केल प्रयोग गरेर देखाइन्छ।स्केल बार = 5 माइक्रोन।c AF488 (αS मा संलग्न) वा Atto647N (Tau मा संलग्न) देखाउने विभिन्न प्रोटीन प्रजातिहरू (थोपा-D-, raft-R- र speckle-P) को लागि αS- को लागि रेकर्ड गरिएको FLIM छविहरूमा पहिचान गरिएका हिस्टोग्रामहरू Tau441 को समय वितरण जीवनकाल र αS/ΔNt-Tau coacervate नमूनाहरू (D का लागि N = 17-32 ROI, R का लागि 29-44 ROI, र अंकहरूको लागि 21-51 ROI)।माध्य र मध्य मानहरू क्रमशः बक्स भित्र पहेंलो वर्ग र कालो रेखाहरूको रूपमा देखाइन्छ।बाकसको तल्लो र माथिल्लो सीमाले क्रमशः पहिलो र तेस्रो चतुर्थकहरूलाई प्रतिनिधित्व गर्दछ, र 1.5-गुना अन्तरक्वार्टाइल दायरा (IQR) भित्रको न्यूनतम र अधिकतम मानहरू व्हिस्कर्सको रूपमा देखाइन्छ।आउटलियरहरू कालो हीराको रूपमा देखाइन्छ।वितरणको जोडीहरू बीचको सांख्यिकीय महत्व असमान भिन्नताहरू मान्दै दुई-नमूना t-परीक्षण प्रयोग गरेर निर्धारण गरिएको थियो।दुई-टेल्ड t-परीक्षण p-मानहरू तुलनात्मक डेटाको प्रत्येक जोडीको लागि ताराहरूका साथ देखाइन्छ (* p-value > 0.01, ** p-value > 0.001, *** p-value > 0.0001, **** p-value > 0.00001), ns ले नगण्यता जनाउँछ (p-value > 0.05)।सटीक p मानहरू पूरक तालिका 1 मा दिइएको छ, र मूल डाटा कच्चा डाटा फाइलहरूको रूपमा प्रस्तुत गरिएको छ।
स्पेकल्स/एग्रीगेट्सको एमाइलोइड-जस्तो प्रकृतिलाई थप प्रदर्शन गर्न, हामीले (1 M) NaCl को उच्च सांद्रताको साथ 24 घण्टासम्म अस्टेन्डेड कोसेर्भेट नमूनाहरू उपचार गर्यौं, जसले प्रोटीन कोसेर्भेटहरूबाट एग्रीगेटहरू अलग गर्यो।जब पृथक समुच्चयहरू (अर्थात्, समुच्चयको छरिएको समाधान) परमाणु बल माइक्रोस्कोपी (AFM) को प्रयोग गरेर अवलोकन गरियो, हामीले लगभग 15 एनएमको नियमित उचाइको साथ मुख्य रूपमा गोलाकार आकारविज्ञान अवलोकन गर्‍यौं, जुन उच्च नुन एकाग्रताको अवस्थाहरूमा सम्बद्ध हुन्छ। सतहमा बलियो हाइड्रोफोबिक प्रभावको कारणले सामान्य एमाइलोइड फाइब्रिलहरूको व्यवहार (ध्यान दिनुहोस् कि फाइब्रिलहरूको उचाइ सामान्यतया ~10 एनएम हुन्छ) (पूरक चित्र। 10a)।चाखलाग्दो कुरा के छ भने, जब पृथक समुच्चयहरू एक मानक ThT प्रतिदीप्ति परखमा ThT सँग इन्क्युबेटेड थिए, हामीले ThT फ्लोरोसेन्स क्वान्टम उपजमा नाटकीय वृद्धि देख्यौं, जब डाई विशिष्ट αS amyloid fibrils (पूरक F10b) सँग इन्क्युबेटेड भएको देखेको तुलनामा तुलनात्मक रूपमा। coacervate समुच्चयमा amyloid-जस्तो संरचनाहरू हुन्छन्।।वास्तवमा, समुच्चयहरू उच्च नुन सांद्रतामा सहिष्णु थिए तर 4 M guanidine chloride (GdnHCl) को प्रति संवेदनशील थिए, जस्तै ठेठ amyloid fibrils (पूरक चित्र 10c)।
अर्को, हामीले एकल अणु प्रतिदीप्ति, विशिष्ट प्रतिदीप्ति सहसंबंध/क्रस-सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी (FCS/FCCS), र दुई-रङ संयोग पत्ता लगाउने (TCCD) को फट विश्लेषण प्रयोग गरेर समुच्चयहरूको संरचनाको विश्लेषण गर्यौं।यस अन्तको लागि, हामीले αS र Tau441 (दुबै 25 μM) 1 μM AF488-लेबल गरिएको αS र 1 μM Atto647N-लेबल Tau441 सहित 100 μl LLPS नमूनाहरूमा इन्क्युबेशनको 24 घण्टा पछि बनेको समुच्चयहरूलाई पृथक गर्‍यौं।LLPS र प्रोटीन बीचको कुनै पनि सम्भावित इलेक्ट्रोस्टेटिक अन्तरक्रियालाई रोक्नको लागि उही PEG-मुक्त बफर र 1 M NaCl (coacervate बाट एग्रीगेटहरू अलग गर्न प्रयोग गरिने एउटै बफर) को प्रयोग गरेर परिणामस्वरूप फैलिएको समग्र समाधानलाई मोनोमोलेक्युलर स्थितिमा पातलो गर्नुहोस्।एकल अणुको समय प्रक्षेपणको उदाहरण चित्र 7a मा देख्न सकिन्छ।FCCS/FCS विश्लेषण (क्रस-सहसंबंध, CC र autocorrelation, AC) ले देखायो कि αS र tau समावेश भएका समुच्चयहरू नमूनाहरूमा प्रचुर मात्रामा थिए (चित्र 7b, बायाँ प्यानलमा CC वक्र हेर्नुहोस्), र अवशिष्ट मोनोमेरिक प्रोटीनको एक अतिरिक्त रूपमा उत्पन्न भयो। कमजोरी प्रक्रियाको परिणाम (चित्र 7b, बायाँ प्यानलमा AC कर्भहरू हेर्नुहोस्)।केवल मोनोमेरिक प्रोटीनहरू भएको नमूनाहरू प्रयोग गरेर एउटै समाधान अवस्थाहरूमा प्रदर्शन गरिएका नियन्त्रण प्रयोगहरूले कुनै CC कर्भहरू देखाएनन्, र AC कर्भहरू एक-घटक प्रसार मोडेल (Eq. 4) सँग राम्रोसँग फिट हुन्छन्, जहाँ मोनोमेरिक प्रोटीनहरूमा अपेक्षित प्रसार गुणांकहरू हुन्छन् (चित्र 7b) दायाँ प्यानल)।एकीकृत कणहरूको प्रसार गुणांक 1 µm2/s भन्दा कम छ, र मोनोमेरिक प्रोटीनहरूको लगभग 1 µm2/s छ।50-100 μm/s;मानहरू सोनिकेटेड αS amyloid fibrils र monomeric αS को लागि समान समाधान अवस्थाहरूमा अलग रूपमा प्रकाशित मानहरू जस्तै छन्।जब हामीले TCCD विस्फोट विश्लेषण (चित्र 7c, शीर्ष प्यानल) को साथ समुच्चयहरूको विश्लेषण गर्यौं, हामीले फेला पार्यौं कि प्रत्येक पृथक समुच्चय (αS/Tau heteroaggregate) मा लगभग 60% पत्ता लगाइएका समुच्चयहरूमा αS र tau दुवै समावेश छन्, लगभग 30% मात्र समावेश छन्। tau, लगभग 10% αS मात्र।αS/Tau heteroaggregates को Stoichiometric विश्लेषणले देखायो कि धेरैजसो heteroaggregates tau मा समृद्ध भएको थियो (stoichiometry 0.5 भन्दा कम, प्रति कुल tau अणुहरूको औसत संख्या αS अणुहरू भन्दा 4 गुणा बढी छ), जुन हाम्रो FLIM मा अवलोकन गरिएको कामसँग अनुरूप छ। प्रयोगहरू।।FRET विश्लेषणले देखाएको छ कि यी समुच्चयहरूमा दुबै प्रोटीनहरू छन्, यद्यपि यस अवस्थामा वास्तविक FRET मानहरू ठूलो महत्त्वको छैनन्, किनकि प्रत्येक समष्टिमा फ्लोरोफोरसको वितरण प्रयोगमा प्रयोग गरिएको लेबल नगरिएको प्रोटीनको अतिरिक्तको कारण अनियमित थियो।चाखलाग्दो कुरा के छ भने, जब हामीले 45,46 परिपक्व एमाइलोइड एग्रिगेसन-कम ताउ भेरियन्ट प्रयोग गरेर उही विश्लेषण प्रदर्शन गर्‍यौं (पूरक चित्र 11a,b हेर्नुहोस्), हामीले याद गर्यौं कि αS इलेक्ट्रोस्ट्याटिक एग्रीगेशन एउटै थियो (पूरक चित्र 11c, dd), coacervate भित्र एग्रीगेट्स बनाउन सक्ने क्षमता एकदमै कम भयो र FLIM ले सिटु प्रयोगहरूमा धेरै स्पटहरू पत्ता लगाए, र पृथक कुल नमूनाहरूको लागि कमजोर क्रस-सम्बन्ध वक्रहरू अवलोकन गरियो।यद्यपि, थोरै संख्यामा पत्ता लगाइएका समुच्चयहरूको लागि (Tau441 को एक दशांश मात्र), हामीले अवलोकन गर्यौं कि प्रत्येक समुच्चयलाई यस Tau संस्करण भन्दा αS मा समृद्ध गरिएको थियो, लगभग 50% पत्ता लगाइएका समुच्चयहरूमा मात्र αS अणुहरू छन्, र αS अधिकमा विषम थियो। ।Tau441 (Fig. 6f) द्वारा उत्पन्न विषम समुच्चयहरूको विपरीत (पूरक चित्र 11e हेर्नुहोस्)।यी प्रयोगहरूको नतिजाले देखायो कि यद्यपि αS आफैं coacervate भित्र tau सँग जम्मा गर्न सक्षम छ, tau nucleation यी अवस्थाहरूमा अधिक अनुकूल छ, र परिणामस्वरूप amyloid-जस्तै समुच्चयहरू αS र tau को रूपको रूपमा कार्य गर्न सक्षम छन्।यद्यपि, एक पटक टाउ-रिच कोर बनाइएपछि, αS र tau बीचको हेटरोटाइपिक अन्तरक्रियाहरू tau अणुहरू बीचको होमोटाइपिक अन्तरक्रियाहरूमा समग्रमा अनुकूल हुन्छन्।हामी तरल αS/tau coacervates मा प्रोटीन नेटवर्कहरू पनि अवलोकन गर्छौं।
αS/Tau441 electrostatic coacervates मा बनेको पृथक समुच्चयहरूको एकल अणुहरूको प्रतिनिधि प्रतिदीप्ति अस्थायी ट्रेसहरू।αS/Tau441 coaggregates (संकेत थ्रेसहोल्ड माथिको फटहरू) सँग सम्बन्धित फटहरू तीन पत्ता लगाउने च्यानलहरूमा अवलोकन गरियो (एएफ४८८ र Atto647N उत्सर्जन पछि प्रत्यक्ष उत्तेजना, नीलो र रातो रेखाहरू, Atto647N उत्सर्जन अप्रत्यक्ष उत्तेजना पछि), FRET, बैजनी रेखा)।LLPS (बायाँ प्यानल) बाट प्राप्त पृथक αS/Tau441 समुच्चय को नमूना को B FCS/FCCS विश्लेषण।AF488 र Atto647N को लागि Autocorrelation (AC) कर्भहरू क्रमशः नीलो र रातो रंगमा देखाइन्छ, र क्रस-सहसंबंध (CC) कर्भहरू दुवै रंगहरू समावेश भएका समुच्चयहरूसँग सम्बन्धित बैजनी रंगमा देखाइन्छ।AC कर्भहरूले लेबल गरिएको मोनोमेरिक र समग्र प्रोटीन प्रजातिहरूको उपस्थितिलाई प्रतिबिम्बित गर्दछ, जबकि CC वक्रहरूले डबल-लेबल गरिएको समुच्चयहरूको मात्र प्रसार देखाउँदछ।उही विश्लेषण, तर पृथक स्थानहरूमा जस्तै समाधान अवस्थाहरूमा, केवल मोनोमेरिक αS र Tau441 समावेश भएका नमूनाहरू दायाँ प्यानलमा नियन्त्रणको रूपमा देखाइन्छ।c αS/Tau441 इलेक्ट्रोस्टेटिक कोसेर्भेट्समा बनेको पृथक समुच्चयहरूको एकल अणुहरूको फ्लोरोसेन्स फ्लैश विश्लेषण।चार फरक दोहोरिने (N = 152) मा पाइने प्रत्येक समग्रको लागि जानकारी तिनीहरूको स्टोइचियोमेट्री, S मानहरू, र FRET दक्षता (शीर्ष प्यानल, रङ पट्टी घटनालाई प्रतिबिम्बित गर्दछ) विरुद्ध प्लट गरिएको छ।तीन प्रकारका समुच्चयहरू छुट्याउन सकिन्छ: S~1 र FRET~0 सँग -αS-मात्र समुच्चय, S~0 र FRET~1 सँग Tau-मात्र समुच्चय, र विषम Tau/αS समुच्चयहरू मध्यवर्ती S र FRET अनुमानित राशिको साथ। प्रत्येक विषम समुच्चय (N = 100) मा पत्ता लगाइएका दुबै मार्कर प्रोटीनहरू तल्लो प्यानलमा देखाइन्छ (रङ स्केलले घटनालाई प्रतिबिम्बित गर्दछ)।कच्चा डाटा कच्चा डाटा फाइल को रूप मा प्रदान गरिन्छ।
तरल प्रोटिनको परिपक्वता वा उमेर बढ्दै जाँदा जेल-जस्तै वा ठोस संरचनाहरूमा घनीभूत हुनुलाई कन्डेनसेट ४७ को धेरै शारीरिक कार्यहरूमा संलग्न भएको र रोगमा पनि समावेश भएको रिपोर्ट गरिएको छ, एमाइलोइड एकत्रीकरण 7, 48, 49 अघिको असामान्य प्रक्रियाको रूपमा। हामी चरण पृथक्करण र व्यवहारलाई विस्तृत रूपमा अध्ययन गर्छौं।LSPT αS कम माइक्रोमोलर सांद्रता र शारीरिक रूपमा सान्दर्भिक अवस्थाहरूमा नियन्त्रित वातावरणमा अनियमित पोलिकेशनहरूको उपस्थितिमा (ध्यान दिनुहोस् कि αS को गणना गरिएको शारीरिक एकाग्रता > 1 µM50 हो), LPS को विशिष्ट थर्मोडायनामिकली चालित व्यवहार पछि।हामीले फेला पार्नुभयो कि αS, जसमा फिजियोलोजिकल pH मा अत्यधिक नकारात्मक रूपमा चार्ज गरिएको C-टर्मिनल क्षेत्र हुन्छ, इलेक्ट्रोस्टेटिक प्रक्रिया मार्फत pLK वा Tau जस्ता अत्यधिक cationic विकारयुक्त पेप्टाइड्सको उपस्थितिमा LLPS मार्फत जलीय घोलमा प्रोटीन युक्त थोपाहरू बनाउन सक्षम छ। एकीकरण macromolecules को उपस्थिति मा जटिल संक्षेपण।यस प्रक्रियाको सेलुलर वातावरणमा सान्दर्भिक प्रभाव हुन सक्छ जहाँ αS ले भिट्रो र vivo51,52,53,54 मा यसको रोग-सम्बन्धित एकत्रीकरणसँग सम्बन्धित विभिन्न polycationic अणुहरूको सामना गर्दछ।
धेरै अध्ययनहरूमा, थोपाहरू भित्र प्रोटीन गतिशीलतालाई परिपक्वता प्रक्रिया 55,56 निर्धारण गर्ने प्रमुख कारकहरू मध्ये एक मानिएको छ।इलेक्ट्रोस्ट्याटिक αS मा polycations संग coacervates, परिपक्वता प्रक्रिया स्पष्ट रूपमा polycations संग अन्तरक्रिया को बल, valence, र यी अन्तरक्रियाहरु को गुणन मा निर्भर गर्दछ।सन्तुलन सिद्धान्तले सुझाव दिन्छ कि दुई तरल अवस्थाको सन्तुलन ल्यान्डस्केप LLPS57,58 ड्राइभ गर्ने बायोपोलिमरहरूमा धनी ठूलो थोपाको उपस्थिति हुनेछ।थोपा वृद्धि Ostwald maturation59, coalescence60 वा फैलिएको चरण61 मा फ्री मोनोमर को खपत द्वारा हासिल गर्न सकिन्छ।αS र Tau441, ΔNt-Tau वा pLK को लागि, धेरैजसो प्रोटिन यस अध्ययनमा प्रयोग गरिएका सर्तहरूमा कन्डेनसेटमा केन्द्रित थियो।यद्यपि, जब पूर्ण-आकारको टाउ थोपाहरू सतह भिजेको समयमा द्रुत रूपमा मिलाइन्छ, ΔNt-Tau र pLK को लागि ड्रपलेट कोलेसेन्स र भिजाउनु गाह्रो थियो, यी दुई प्रणालीहरूमा तरल गुणहरूको द्रुत हानिको सुझाव दिन्छ।हाम्रो FLIM-FRET विश्लेषणका अनुसार, वृद्ध pLK र ΔNt-Tau ड्रपलेटहरूले मूल थोपाहरूको रूपमा प्रोटीन एकत्रीकरणको समान डिग्री (समान फ्लोरोसेन्स जीवनकाल) देखाए, सुझाव दिन्छ कि मूल प्रोटीन नेटवर्क कायम राखिएको थियो, यद्यपि अधिक कठोर।
हामी निम्न मोडेलमा हाम्रो प्रयोगात्मक नतिजाहरूलाई तर्कसंगत बनाउँछौं (चित्र 8)।प्रारम्भिक रूपमा अस्थायी रूपमा बनाइएका थोपाहरू प्रायः इलेक्ट्रोस्टेटिक क्षतिपूर्ति बिना प्रोटीन नेटवर्कहरू हुन्, र यसैले त्यहाँ चार्ज असंतुलनका क्षेत्रहरू छन्, विशेष गरी ड्रपलेट इन्टरफेसमा, उच्च इलेक्ट्रोस्टेटिक सतह क्षमताको साथ थोपाहरूको परिणाम स्वरूप।चार्जको क्षतिपूर्ति गर्न (सामान्यतया भ्यालेन्स डिप्लेसन भनिन्छ) र थोपाहरूको सतह क्षमतालाई कम गर्न, थोपाहरूले पातलो चरणबाट नयाँ पोलिपेप्टाइडहरू समावेश गर्न सक्छन्, चार्ज-चार्ज अन्तरक्रियाहरू अनुकूलन गर्न प्रोटीन नेटवर्कहरू पुन: संगठित गर्न सक्छन्, र अन्य थोपाहरूसँग अन्तरक्रिया गर्न सक्छन्।सतहहरु (भिजाउने) संग।αS/pLK थोपाहरू, तिनीहरूको सरल प्रोटीन नेटवर्क (αS र pLK बीच मात्र heterotypic अन्तरक्रिया) र प्रोटीन-प्रोटिन अन्तरक्रियाहरूको लागि अधिक आत्मीयताको कारण, कन्डेनसेटको चार्जलाई अझ छिटो सन्तुलनमा राख्न सक्षम देखिन्छ;वास्तवमा, हामीले प्रारम्भिक रूपमा गठन गरिएका αS/pLK coacervates मा αS/Tau भन्दा छिटो प्रोटीन गतिविज्ञान देख्यौं।भ्यालेन्स डिप्लेसन पछि, अन्तरक्रियाहरू कम अल्पकालिक हुन्छन् र थोपाहरूले आफ्नो तरल गुणहरू गुमाउँछन् र कम इलेक्ट्रोस्ट्याटिक सतह क्षमताको साथ जेल-जस्तो, गैर-ज्वलनशील थोपाहरूमा परिणत हुन्छन् (र त्यसैले सतह भिजाउन असमर्थ)।यसको विपरित, αS/Tau ड्रपलेटहरू अधिक जटिल प्रोटीन नेटवर्कहरू (होमोटाइपिक र हेटरोटाइपिक अन्तर्क्रियाहरू दुवैसँग) र प्रोटीन अन्तरक्रियाहरूको कमजोर प्रकृतिको कारण ड्रपलेट चार्ज ब्यालेन्स अनुकूलन गर्न कम कुशल हुन्छन्।यसले थोपाहरूमा परिणाम दिन्छ जसले विस्तारित अवधिको लागि तरल व्यवहार कायम राख्छ र उच्च इलेक्ट्रोस्ट्याटिक सतह क्षमता प्रदर्शन गर्दछ जुन कोलेसिङ र बढ्दै (यसले थोपाहरूको सतह क्षेत्र/भोल्युम अनुपातलाई कम गरेर) र हाइड्रोफिलिक सतह रसायनलाई भिजाएर कम गर्न सकिन्छ।यसले ठूला केन्द्रित प्रोटीन पुस्तकालयहरू सिर्जना गर्दछ जसले तरल पदार्थको गुणहरू कायम राख्छ किनभने अन्तरक्रियाहरू प्रोटीन नेटवर्कमा चार्ज अप्टिमाइजेसनको लागि निरन्तर खोजको कारणले धेरै क्षणिक रहन्छ।चाखलाग्दो कुरा के छ भने, Tau को N-टर्मिनल रूपमा काटिएका रूपहरू, जसमा केही प्राकृतिक रूपमा हुने isoforms62, मध्यवर्ती व्यवहार प्रदर्शन गर्दछ, केही coacervates αS सँग दीर्घकालीन जेल-जस्तै थोपाहरूमा परिणत हुन्छन्, जबकि अरूहरू ठूला तरल कन्डेनसेटहरूमा परिणत हुन्छन्।αS electrostatic coacervates को परिपक्वता मा यो द्वैत हालैको LLPS सैद्धान्तिक र प्रयोगात्मक अध्ययन संग संगत छ कि कन्डेन्सेट आकार र तरल गुणहरु को नियन्त्रण को लागी एक कुञ्जी को रूप मा कन्डेनसेट मा इलेक्ट्रोस्टेटिक सिभिंग को बीच एक सम्बन्ध को पहिचान गरेको छ।संयन्त्र ५८.६१।
यो योजनाले LLPS र LSPT मार्फत αS र Tau441 को लागि putative amyloid एकत्रीकरण मार्ग देखाउँछ।अतिरिक्त आयोन-रिच (रातो) र क्याशन-रिच (नीलो) क्षेत्रहरूमा, सन्तोषजनक भ्यालेन्सका साथ αS र टाउ इलेक्ट्रोस्टेटिक कोसेर्भेटहरूको सतहको ऊर्जा कम हुन्छ र त्यसैले कम एकीकरण हुन्छ, जसको परिणामस्वरूप द्रुत थोपा बुढो हुन्छ।एक स्थिर गैर-संग्रहित जेल राज्य प्राप्त भयो।।यो स्थिति αS/pLK प्रणालीको मामलामा यसको उच्च आत्मीयता र सरल प्रोटीन-जोडा अन्तरक्रिया सञ्जालको कारणले धेरै अनुकूल छ, जसले छिटो जेल-जस्तो संक्रमणको लागि अनुमति दिन्छ।यसको विपरित, असन्तोषजनक भ्यालेन्स भएका थोपाहरू र यसैले, अन्तरक्रियाको लागि उपलब्ध प्रोटिन-चार्ज गरिएका क्षेत्रहरूले यसको उच्च सतह ऊर्जा कम गर्न कोसेर्भेटलाई हाइड्रोफिलिक सतहलाई फ्यूज गर्न र भिजाउन सजिलो बनाउँदछ।यो अवस्था αS/Tau441 coacervates को लागि उपयुक्त छ, जसमा कमजोर Tau-Tau र αS-Tau अन्तरक्रियाहरू समावेश भएको बहुसंयोजक जटिल नेटवर्क छ।बारीमा, ठूला कोसेर्भेटहरूले आफ्नो तरल पदार्थ-जस्तै गुणहरू सजिलै कायम राख्छन्, जसले अन्य प्रोटीन-देखि-प्रोटिन अन्तरक्रियाहरू हुन अनुमति दिन्छ।अन्ततः, कोसेर्भेट फ्लुइड भित्र αS र tau फारम दुवै समावेश गर्ने amyloid heterogeneous समुच्चयहरू, जुन समावेशी निकायहरूमा पाइनेहरूसँग सम्बन्धित हुन सक्छ, जुन न्यूरोडिजेनेरेटिभ रोगहरूको विशेषता हो।
αS/Tau441 को परिपक्वताको समयमा बनाइएका ठूला तरल-जस्तै संरचनाहरू अत्यधिक भीडभाड तर गतिशील प्रोटीन वातावरणको साथ र थोरै हदसम्म, αS/ΔNt-Tau coacervates प्रोटीन एकत्रीकरणको न्यूक्लिएशनको लागि आदर्श जलाशयहरू हुन्।हामीले वास्तवमा यस प्रकारको प्रोटीन कोसेर्भेटहरूमा ठोस प्रोटीन समुच्चयहरूको गठन अवलोकन गरेका छौं, प्रायः दुबै αS र tau समावेश गर्दछ।हामीले देखेका छौं कि यी हेटेरोएग्रिगेटहरू गैर-इलेक्ट्रोस्टेटिक अन्तरक्रियाहरूद्वारा स्थिर हुन्छन्, एमाइलोइड-विशिष्ट ThT रंजकहरूलाई सामान्य amyloid fibrils जस्तै बाँध्न सक्षम छन्, र वास्तवमा विभिन्न प्रभावहरूमा समान प्रतिरोध छ।LLPS द्वारा गठित αS/tau समुच्चयहरूमा amyloid-जस्तो गुणहरू देखाइएको थियो।वास्तवमा, amyloid एकत्रीकरण मा Tau को कमी को परिपक्व संस्करण तरल इलेक्ट्रोस्टेटिक coacervate भित्र यी विषम αS समुच्चय को गठन मा उल्लेखनीय रूपमा बिग्रिएको छ।αS/Tau441 एग्रीगेट्सको गठन केवल coacervates भित्रै देखियो, जसले तरल-जस्तो गुणहरू कायम राख्यो, र यदि coacervates/थोपाहरू जेल राज्यमा पुगेनन् भने।पछिल्लो अवस्थामा, इलेक्ट्रोस्टेटिक अन्तरक्रियाको बढ्दो शक्ति र परिणामस्वरूप, प्रोटीन नेटवर्कको कठोरताले प्रोटीनहरूको आवश्यक संरचनात्मक पुनर्संरचनालाई रोक्छ जसले एमाइलोइड न्यूक्लिएसनको लागि आवश्यक नयाँ प्रोटीन अन्तरक्रियाहरू स्थापना गर्दछ।यद्यपि, यो अधिक लचिलो, तरल-जस्तै कोसेर्भेटहरूमा प्राप्त गर्न सकिन्छ, जुन आकारमा बढ्दै जाँदा तरल रहने सम्भावना बढी हुन्छ।
सघन चरण भित्र एग्रीगेटहरूको गठन द्रुत रूपमा जेल हुने साना थोपाहरूमा भन्दा ठूलो αS/Tau कन्डेनसेटहरूमा राम्रो हुन्छ भन्ने तथ्यले ड्रपलेट कोलेसेन्स नियन्त्रण गर्ने कारकहरू पहिचान गर्ने प्रासंगिकतालाई हाइलाइट गर्दछ।तसर्थ, फेज पृथकीकरणको प्रवृति मात्र होइन, तर रोगको रोकथामका लागि कन्डेन्सेटको साइजलाई पनि नियन्त्रण गर्नुपर्दछ।हाम्रा परिणामहरूले αS/Tau प्रणालीको लागि LLPS र LSPT बीचको सन्तुलनको महत्त्वलाई पनि हाइलाइट गर्दछ।जबकि ड्रपलेट गठनले संतृप्ति अवस्थाहरूमा उपलब्ध प्रोटीन मोनोमरहरूको मात्रा घटाएर एमाइलोइड एकत्रीकरण विरुद्ध सुरक्षा गर्न सक्छ, जस्तै अन्य प्रणालीहरू63,64 मा प्रस्तावित गरिएको छ, उच्च थोपा स्तरहरूमा ड्रपलेट फ्युजनले ढिलो संरचनात्मक पुनर्संरचना मार्फत आन्तरिक प्रोटीन एकत्रीकरण गर्न सक्छ।प्रोटीन नेटवर्कहरू।।
समग्रमा, हाम्रो डेटाले LSPT को सन्दर्भमा ड्रप नेटवर्कहरूमा एकजुट भ्यालेन्स र सन्तुष्ट/असन्तुष्ट अन्तरक्रियाहरूको सान्दर्भिकतालाई जोड दिन्छ।विशेष रूपमा, हामी देखाउँछौं कि पूर्ण-लम्बाइ αS/Tau441 कन्डेनसेटहरू प्रभावकारी रूपमा फ्यूज गर्न सक्षम छन् र amyloid-जस्तै heteroaggregates बनाउनका लागि दुवै प्रोटीनहरू समावेश गर्दछ र हाम्रो प्रयोगात्मक परिणामहरूमा आधारित एक आणविक संयन्त्र प्रस्ताव गर्दछ।αS/Tau fluid coacervate मा दुई प्रोटिनहरूको सह-एकत्रीकरण जुन हामीले यहाँ रिपोर्ट गर्छौं, वास्तवमा समावेशीकरणमा दुई प्रोटीनहरूको सह-स्थानीयकरणसँग सम्बन्धित हुन सक्छ, जुन रोगको विशेषता हो, र LLPS र LLPS बीचको सम्बन्ध बुझ्न योगदान गर्न सक्छ। amyloid एकत्रीकरण, न्यूरोडिजेनरेशनमा अत्यधिक चार्ज गरिएको IDP को लागि मार्ग प्रशस्त गर्दै।
Monomeric WT-αS, cysteine ​​mutants (Q24C-αS, N122C-αS) र ΔCt-αS भेरियन्टहरू (Δ101-140) E. coli मा व्यक्त गरिएको थियो र पहिले वर्णन गरिए अनुसार शुद्ध गरियो।5 mM DTT लाई डाइसल्फाइड बन्ड गठन रोक्नको लागि αS सिस्टिन म्युटेन्ट्सको शुद्धिकरणमा सबै चरणहरूमा समावेश गरिएको थियो।Tau441 isoform (Addgene #16316 बाट प्राप्त प्लाज्मिड), ΔNt-Tau variant (Δ1-150, प्राइमरहरू CTTTAAGAAGGAGATACATGATCGCCACACCCGCGG, CATATGTATCCTCTCTTCTTAAAGTTAA53) Δ1-150 प्राइमरहरूद्वारा प्राप्त गरिएको GGCTC5 प्राइमरको साथ) ई. कोलाई कल्चरहरू थिए OD600 = 0.6–0.7 मा 37°C र 180 rpm मा बढ्यो, र 37°C मा 3 घण्टाको लागि IPTG मार्फत अभिव्यक्ति प्रेरित गरियो।11,500 xg मा 15 मिनेटको लागि 4 °C मा कोषहरू काट्नुहोस् र 150 mM NaCl भएको नुन बफरले धुनुहोस्।लाइसिस बफरमा गोली पुन: सस्पेन्ड गर्नुहोस् (20 ml प्रति 1 L LB: MES 20 mM, pH 6.8, NaCl 500 mM, EDTA 1 mM, MgCl2 0.2 mM, DTT 5 mM, PMSF 1 mM, benzamidine, 50 μpeμpinMM)।सोनिकेशन चरण 10 दालहरू (1 मिनेट अन, 1 मिनेट बन्द) को लागि 80% को एक आयाम संग बर्फ मा प्रदर्शन गरिएको थियो।एक अल्ट्रासाउन्डमा 60 मिलीलीटर भन्दा बढी नगर्नुहोस्।ई. कोलाई लाइसेट्सलाई ९५ डिग्री सेल्सियसमा २० मिनेटको लागि तताइयो, त्यसपछि बरफमा चिसो पारियो र ४० मिनेटको लागि १२७,००० × ग्राममा सेन्ट्रीफ्युज गरियो।स्पष्ट सुपरनेटेन्ट 3.5 kDa झिल्ली (स्पेक्ट्रम™ थर्मो फिशर वैज्ञानिक, यूके) मा लागू गरिएको थियो र 4 L डायलिसिस बफर (20 mM MES, pH 6.8, NaCl 50 mM, EDTA 1 mM, MgMTT, D2 m2 mM) विरुद्ध डायलाइज गरियो। , PMSF 0.1 mM) 10 घण्टाको लागि।एक 5 ml cation विनिमय स्तम्भ (HiTrap SPFF, Cytiva, MA, USA) सन्तुलन बफर (20 mM MES, pH 6.8, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM MgCl2, 2 mM DTT, PTM0) सँग सन्तुलित गरिएको थियो।Tau lysate लाई 0.22 μm PVDF फिल्टर मार्फत फिल्टर गरिएको थियो र 1 ml/min को प्रवाह दरमा स्तम्भमा इन्जेक्ट गरियो।बिस्तारै इलुसन गरिएको थियो, टाउलाई १५–३०% इल्युसन बफर (२० एमएम एमईएस, पीएच ६.८, १ एम नासीएल, १ एमएम ईडीटीए, २ एमएम एमजीसीएल २, २ एमएम डीटीटी, ०.१ एमएम पीएमएसएफ) सँग एल्युट गरिएको थियो।SDS-PAGE द्वारा भिन्नहरू विश्लेषण गरिएको थियो, र Tau को अपेक्षित आणविक वजनको साथ एक ब्यान्ड भएको कुनै पनि अंशहरू 10 kDa सेन्ट्रीफ्यूज फिल्टर प्रयोग गरेर केन्द्रित थिए र 10 mM HEPES, pH 7.4, NaCl 500 mM र DTT m2 को लागि बफरको साथ प्रतिस्थापित गरियो। अन्तिम प्रोटीन एकाग्रता 100 μM थियो।प्रोटिनको घोललाई ०.२२ μm PVDF फिल्टर मार्फत पारित गरियो, चाँडै जमेको र -80 डिग्री सेल्सियसमा भण्डारण गरियो।प्रोटिन K18 दयालु प्रो अल्बर्टो बोफी द्वारा प्रदान गरिएको थियो।SDS-PAGE र MALDI-TOF/TOF द्वारा पुष्टि गरे अनुसार तयारीको शुद्धता >95% थियो।विभिन्न सिस्टिनहरूलाई रासायनिक रूपमा AlexaFluor488-maleimide (AF488, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA) वा TEMPOL-maleimide (टोरन्टो रिसर्च केमिकल्स, टोरन्टो, क्यानडा) ले लेबल गरिएको थियो।अवशोषण र MALDI-TOF/TOF द्वारा पुष्टि गरिएको थियो।Tau441, ΔNt-Tau, AggDef-Tau र K18 एउटै प्रक्रिया पछ्याउँदै Atto647N-maleimide (ATTO-TEC GmbH, Siegen, Germany) को प्रयोग गरेर 191 र 322 स्थितिमा नेटिभ सिस्टिन अवशेषहरूसँग लेबल गरिएको थियो।αS र Tau441 को लागि प्रति अवशिष्ट नक्सा CIDER66 को प्रयोग गरेर नेट चार्ज उत्पन्न गरियो।
ठोस पाली-एल-लाइसिन (pLK DP 90-110 आपूर्तिकर्ता NMR अनुसार, Alamanda Polymers Inc, Huntsville, Alabama, USA) 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, pH 7.4 देखि 10 mM एकाग्रतामा विघटन गरिएको थियो, प्रक्रियाको लागि sonicated अल्ट्रासोनिक पानीको नुहाउनेमा मिनेट र -20 डिग्री सेल्सियसमा भण्डार गर्नुहोस्।PEG-8, dextran-70, FITC-PEG-10 (Biochempeg, Watertown, MA, USA) र FITC-dextran-500 (Sigma-Aldrich, Sant Louis, MI, USA) पानीमा घुलनशील र LLPS बफरमा व्यापक रूपमा वितरित छन्।डायलाइसिसले दूषित लवण हटाउँछ।तिनीहरू त्यसपछि 0.22 μm को छिद्र साइजको साथ सिरिन्ज फिल्टर मार्फत फिल्टर गरियो, र तिनीहरूको सांद्रता रिफ्रेक्टोमीटर (मेटलर टोलेडो, कोलम्बस, ओहायो, संयुक्त राज्य अमेरिका) को प्रयोग गरेर गणना गरियो।LLPS नमूनाहरू निम्न क्रममा कोठाको तापक्रममा तयार पारिएका थिए: बफर र एक्सट्रुसन मिलाइयो र 1 mM tris (2-carboxyethyl) phosphine (TCEP, Carbosynth, Compton, UK), 1 mM 2,2,2,2-(Ethane- 1, 2-diyldinitrile) tetraacetic एसिड (EDTA, carboxynth) र 1% प्रोटीज अवरोधक (PMSF 100 mM, benzimide 1 mM, leupeptin 5 μM) को मिश्रण।त्यसपछि αS र फ्युज्ड पोलिकेसनहरू (विकल्पहरू pLK वा Tau) थपिन्छन्।thioflavin-T समय श्रृंखला प्रयोगहरू (ThT, Carbosynth, Compton, UK), कुल ThT एकाग्रता आधा αS एकाग्रता हुन प्रयोग गर्नुहोस्।बिस्तारै तर राम्ररी मिश्रण गर्नुहोस् कि तिनीहरू एकरूप छन् भनेर सुनिश्चित गर्न नमूनाहरू।प्रत्येक कम्पोनेन्टको एकाग्रता प्रयोगदेखि प्रयोगमा भिन्न हुन्छ, परिणाम खण्डमा वर्णन गरिए अनुसार।Azide 0.02% (w/v) को एकाग्रतामा प्रयोग गरिएको थियो जब पनि प्रयोगको अवधि 4 घण्टा नाघ्यो।LLPS नमूनाहरू प्रयोग गरी सबै विश्लेषणहरूका लागि, विश्लेषण गर्नु अघि 5 मिनेटको लागि मिश्रणलाई सन्तुलनमा राख्न अनुमति दिनुहोस्।लाइट स्क्याटरिङ विश्लेषणको लागि, 150 μl नमूनाहरू गैर-बाइन्डिङ 96-वेल माइक्रोप्लेटहरूमा लोड गरियो (µClear®, कालो, F-Bottom/Chimney Well, Greiner bio-one, Kremsmünster, Austria) र टाँसिने फिल्मले ढाकिएको थियो।CLARIOstar प्लेट रिडर (BMG Labtech, Ortenberg, Germany) मा समाधानको केन्द्रमा 350 nm मा अवशोषण मापन गरेर LLPs लाई निगरानी गरिएको थियो।प्रयोगहरू 25 डिग्री सेल्सियसमा ट्रिपलिकेटमा गरिएको थियो, र त्रुटिहरूलाई माध्यबाट मानक विचलनको रूपमा गणना गरिएको थियो।पातलो चरण नमूना centrifugation र SDS-PAGE जेल विश्लेषण द्वारा मापन गरिएको थियो, र पातलो र केन्द्रित चरणहरूमा αS अंश विभिन्न LLPS समाधानहरूमा परिमाण गरिएको थियो।1 μM AF488-लेबल गरिएको αS समावेश भएको 100 μl LLPS नमूनालाई 30 मिनेटको लागि 9600xg मा सेन्ट्रीफ्युगेशन पछि पूर्ण रूपमा मिश्रण गरेर तयार गरिएको थियो, जस पछि प्राय: प्रक्षेपण देखिन्थ्यो।SDS-PAGE जेल प्रयोग गरेर प्रोटिन क्वान्टिफिकेशनको लागि supernatant को शीर्ष 50 μl प्रयोग गरिएको थियो।जेलहरूलाई ChemiDoc जेल इमेजिङ प्रणाली (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) को प्रयोग गरेर AF488 फिल्टरहरूसँग स्क्यान गरिएको थियो वा Coomassie दागले दाग लगाइएको थियो र उपयुक्त फिल्टरहरूद्वारा कल्पना गरिएको थियो।नतिजा ब्यान्डहरू ImageJ संस्करण 1.53i (National Institutes of Health, USA) को प्रयोग गरेर विश्लेषण गरियो।प्रयोगहरू समान परिणामहरूको साथ दुई फरक प्रयोगहरूमा डुप्लिकेटमा गरिएको थियो।
सामान्यतया, 150 μl नमूनाहरू गैर-बाइन्डिङ 96-वेल माइक्रोप्लेटहरूमा लागू गरियो र कोठाको तापक्रममा Leica DMI6000B इन्भर्टेड माइक्रोस्कोप (Leica Microsystems, Wetzlar, Germany) मा भिजुअलाइज गरियो।स्पट प्रयोगहरूका लागि, µ-स्लाइड एन्जियोजेनेसिस प्लेटहरू (Ibidi GmbH, Gräfelfing, जर्मनी) वा 96-वेल पोलिस्टीरिन माइक्रोप्लेटहरू (Corning Costar Corp., Acton, Massachusetts) पनि प्रयोग गरियो।EL6000 हलोजन वा पारा धातु हलाइड बत्तीहरू रोशनी स्रोतको रूपमा प्रयोग गरियो (क्रमशः BF/DIC र WF इमेजिङका लागि)।WF माइक्रोस्कोपीको लागि, नमूनामा प्रकाश फोकस गर्न र यसलाई सङ्कलन गर्न 40x म्याग्निफिकेसन एयर उद्देश्य (Leica Microsystems, Germany) प्रयोग गरिएको थियो।AF488 र ThT लेबल गरिएको नमूनाहरूको लागि, मानक GFP फिल्टर सेटहरू, उत्तेजना र उत्सर्जन ब्यान्डपास फिल्टरहरू, क्रमशः 460–500 nm र 512-542 nm ब्यान्डपास फिल्टरहरू, र एक 495 nm dichro मार्फत फिल्टर उत्तेजना र उत्सर्जन।Atto647N ले लेबल गरिएको नमूनाहरूको लागि, उत्तेजना र उत्सर्जन ब्यान्डपास फिल्टरहरू 628–40 nm र 692–40 nm, क्रमशः, र 660 nm dichroic मिररको साथ Cy5 फिल्टरहरूको मानक सेट प्रयोग गरियो।BF र DIC माइक्रोस्कोपीको लागि, समान प्रतिबिम्बित प्रकाश संग्रह उद्देश्य प्रयोग गर्नुहोस्।सङ्कलन गरिएको प्रकाश Leica DFC7000 CCD क्यामेरा (Leica Microsystems, Germany) मा रेकर्ड गरिएको थियो।एक्सपोजर समय BF र DIC माइक्रोस्कोपी इमेजिङको लागि 50 ms र WF माइक्रोस्कोपी इमेजिङको लागि 20-100 ms थियो।तुलनाको लागि, ThT सँग सबै प्रयोगहरूको लागि एक्सपोजर समय 100 ms थियो।टाइम-लेप्स प्रयोगहरू ड्रपलेट कोलेसेन्सको कल्पना गर्न प्रदर्शन गरिएको थियो, छविहरू प्रत्येक 100 ms मा धेरै मिनेटको लागि सङ्कलन गरिएको थियो।ImageJ (NIH, USA) छवि विश्लेषणको लागि प्रयोग गरिएको थियो।प्रयोगहरू समान नतिजाहरूका साथ ट्रिपलिकेटमा गरिएको थियो।
स्थानीयकरण प्रयोगहरू, FRAP र 3D पुनर्निर्माणका लागि, छविहरू ZEN 2 निलो संस्करण (कार्ल Zeiss AG, Oberkochen, जर्मनी) को प्रयोग गरेर Zeiss LSM 880 उल्टो कन्फोकल माइक्रोस्कोपमा प्राप्त गरियो।50 μl को नमूनाहरू µ-स्लाइड एंजियोजेनेसिस पेट्री डिश (Ibidi GmbH, Gröfelfing, जर्मनी) मा लागू गरियो, हाइड्रोफिलिक पोलिमर (ibiTreat) को साथ उपचार गरियो र 63× तेल इमर्सन उद्देश्यमा माउन्ट गरियो DIC मा)।छविहरू 458 nm, 488 nm, र 633 nm आर्गन लेजर लाइनहरू 0.26 µm/पिक्सेलको रिजोल्युसन र 8 µs/पिक्सेलको एक्सपोजर समय 470–600 – nm, 6239 nm, 6248nm को उत्तेजना र उत्सर्जन पत्ता लगाउने विन्डोहरूका लागि प्राप्त गरियो। र 638–755 nm क्रमशः ThT, AF488 र Atto647N कल्पना गर्न प्रयोग गरिएको थियो।FRAP प्रयोगहरूको लागि, प्रत्येक नमूनाको टाइम-लेप्स फोटोग्राफी 1 फ्रेम प्रति सेकेन्डमा रेकर्ड गरिएको थियो।प्रयोगहरू समान नतिजाहरूको साथ कोठाको तापक्रममा ट्रिपलिकेटमा गरिएको थियो।सबै छविहरू Zen 2 ब्लू संस्करण सफ्टवेयर (कार्ल Zeiss AG, Oberkochen, जर्मनी) प्रयोग गरेर विश्लेषण गरिएको थियो।OriginPro 9.1 को प्रयोग गरेर Zen 2 को प्रयोग गरेर छविहरूबाट निकालिएको तीव्रता/समय डेटामा FRAP कर्भहरू सामान्यीकृत, प्लट र फिट गरियो।रिकभरी कर्भहरू एक मोनो-एक्सपोनेन्शियल मोडेलमा जडान गरिएको थियो जसमा आणविक प्रसारको लागि एक अतिरिक्त घातीय शब्दको साथ अधिग्रहण ब्लीचिंग प्रभावको लागि खाता बनाइएको थियो।हामीले त्यसपछि नाममात्र ब्लिचिङ त्रिज्या प्रयोग गरेर D गणना गर्यौं र पहिले नै निर्धारण गरिएको रिकभरी हाफ-लाइफ Kang et al को समीकरणमा जस्तै।५३५ देखाइएको छ।
αS को एकल सिस्टीन भेरियन्टहरू 4-hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidine-N-oxyl (TEMPOL) सँग 24 (TEMPOL-24-αS) र 122 (TEMPOL-122-αS) मा संश्लेषित गरिएको थियो, क्रमशः।स्पिन लेबलिंग EPR प्रयोगहरूको लागि, αS एकाग्रता 100 μM मा सेट गरिएको थियो र PEG एकाग्रता 15% (w/v) थियो।विभिन्न एकत्रीकरण अवस्थाहरूको लागि, αS:pLK अनुपात 1:10 थियो, जबकि αS:ΔNt-Tau र αS:Tau441 अनुपात 1:1 मा कायम राखिएको थियो।भीडको अनुपस्थितिमा बाइन्डिङ टाइट्रेसन प्रयोगहरूको लागि, TEMPOL-122-αS 50 μM मा राखिएको थियो र polycations बढ्दो एकाग्रतामा टायट्रेट गरिएको थियो, प्रत्येक अवस्थालाई अलग-अलग तयारी गर्दै।CW-EPR मापनहरू ~ 9.7 GHz को माइक्रोवेभ (SHF) फ्रिक्वेन्सीमा सञ्चालन गर्ने Bruker ER4118 SPT-N1 रेजोनेटरसँग सुसज्जित Bruker ELEXSYS E580 X-ब्यान्ड स्पेक्ट्रोमिटर प्रयोग गरी गरिएको थियो।तापमान 25 डिग्री सेल्सियस मा सेट गरिएको थियो र तरल नाइट्रोजन क्रायोस्टेट द्वारा नियन्त्रण गरिएको थियो।स्पेक्ट्रा 4 mW को MW पावर, 0.1 mT को एक मोड्युलेशन आयाम, र 100 kHz को एक मोडुलेशन आवृत्ति मा असंतृप्त अवस्था अन्तर्गत प्राप्त गरियो।Tau441 वा ΔNt-Tau (मूल प्रोटीन समाधानहरूमा उपस्थित) भएका नमूनाहरूमा घटाउने एजेन्टहरूको अवशिष्ट सांद्रताको कारण नमूनाहरू र सम्भावित स्पिन घटाउने बीचको स्पिन सांद्रतामा भिन्नताहरूबाट बच्न स्पेक्ट्रल तीव्रताहरू सामान्यीकृत गरियो।G को दिइएको मानहरू Matlab®67 मा लागू गरिएको Easyspin सफ्टवेयर (v. 6.0.0-dev.34) को प्रयोग गरेर प्रदर्शन गरिएको EPR स्पेक्ट्रल मोडलिङको परिणाम स्वरूप प्राप्त गरिएको थियो।डेटा मोडेल गर्न एक/दुई कम्पोनेन्ट आइसोट्रोपिक मोडेलहरू प्रयोग गरियो।सबै संकेतहरू सामान्य गरेपछि, अवशिष्टहरू सम्बन्धित प्रयोगात्मक स्पेक्ट्रमबाट प्रत्येक सिमुलेशन घटाएर गणना गरियो।बाइन्डिङ टाइट्रेसन विश्लेषणको लागि, सामान्यीकृत EPR स्पेक्ट्रम (IIII/III) को दोस्रो ब्यान्डमा तेस्रो ब्यान्डको सापेक्षिक तीव्रता αS मा polycations को बाध्यकारी निगरानी गर्न प्रयोग गरिएको थियो।पृथक स्थिरता (Kd) अनुमान गर्नको लागि, नतिजा वक्र n समान र स्वतन्त्र बाध्यकारी साइटहरू मान्दै अनुमानित मोडेलमा फिट गरिएको थियो।
NMR स्पेक्ट्रोस्कोपी प्रयोगहरू Bruker Neo 800 MHz (1H) NMR स्पेक्ट्रोमिटर क्रायोप्रोब र Z-ग्रेडियन्टले सुसज्जित प्रयोग गरी गरियो।सबै प्रयोगहरू 130-207 µM αS र 10 mm HEPES, 100 mM NaCl, 10% DO, pH 7.4 मा αS/ΔNt-Tau र pLK समकक्षहरू प्रयोग गरेर प्रदर्शन गरियो र 15 ° C मा प्रदर्शन गरियो।NMR द्वारा LPS अनुगमन गर्न, 10% PEG पूर्व-मिश्रित नमूनाहरूमा थपिएको थियो।केमिकल शिफ्ट पर्चरबेशन प्लट (चित्र 1b) ले औसत 1H र 15N रासायनिक परिवर्तनहरू देखाउँछ।αS 2D1H-15N HSQC स्पेक्ट्रा अघिल्लो असाइनमेन्ट (BMRB प्रविष्टि #25227) को आधारमा तोकिएको थियो र HNCA, HNCO र CBCAcoNH को 3D स्पेक्ट्रा रेकर्डिङ र विश्लेषण गरेर पुष्टि गरिएको थियो।13Cα र 13Cβ रासायनिक परिवर्तनहरू ΔNt-Tau वा pLK को उपस्थितिमा गणना गरिएको थियो शुद्ध अनियमित कुण्डल संरचना 68 (पूरक चित्र 5c) मा αS रासायनिक परिवर्तनहरूको तुलनामा माध्यमिक संरचना प्रवृत्तिहरूमा सम्भावित परिवर्तनहरू मापन गर्न।R1ρ दरहरू 8, 36, 76, 100, 156, 250, 400, र 800 ms को ढिलाइको साथ hsqctretf3gpsi प्रयोगहरू (ब्रुकर लाइब्रेरीबाट प्राप्त) रेकर्ड गरेर मापन गरियो, र घातीय प्रकार्यहरू ढिलाइ शिखरमा फरक फरकमा समायोजन गरियो। R1ρ र यसको प्रयोगात्मक अनिश्चितता निर्धारण गर्न समय।
दुई-रङ समय-समाधान फ्लोरोसेन्स माइक्रोस्कोपी प्रयोगहरू व्यावसायिक समय-समाधान गरिएको MT200 फ्लोरोसेन्स कन्फोकल माइक्रोस्कोप (PicoQuant, बर्लिन, जर्मनी) मा समय-सम्बन्धित एकल फोटोन गणना (TCSPC) उपकरणको साथ प्रदर्शन गरिएको थियो।लेजर डायोड हेड पल्स्ड इन्टरलिभ्ड एक्सिटेशन (PIE) को लागि प्रयोग गरिन्छ, बीम एकल मोड वेभगाइड मार्फत जान्छ र 10 देखि 100 nW को लेजर पावरमा 481 nm र 637 nm लेजर लाइनहरू dichroic मिरर पछि मापन गरिन्छ।यसले फोटोन एलियासिङ, फोटोब्लिचिङ र संतृप्तिको प्रभावलाई बेवास्ता गर्दै इष्टतम फोटोन गणना दर सुनिश्चित गर्दछ।μ-स्लाइड एन्जियोजेनेसिस कभरस्लिप वा प्लेटहरू (Ibidi GmbH, Gräfelfing, जर्मनी) एक सुधारात्मक कलर (ओलम्पस लाइफ साइन्सेस, वाल्थम, संयुक्त राज्य अमेरिका) को साथ सुपर एपोक्रोम्याट 60x NA 1.2 लेन्समा सिधै डुब्न पानीमा राखिएको थियो।A 488/640 nm dichroic मिरर (Semrock, Lake Forest, IL, USA) मुख्य बीम स्प्लिटरको रूपमा प्रयोग गरिएको थियो।फोकस नगरिएको विकिरणलाई ५० माइक्रोनको व्यास भएको प्वालद्वारा अवरुद्ध गरिएको छ, त्यसपछि केन्द्रित विकिरणलाई ५०/५० बीम स्प्लिटरद्वारा २ पत्ता लगाउने मार्गमा विभाजन गरिएको छ।ब्यान्डपास उत्सर्जन फिल्टरहरू (Semrock, Lake Forest, IL, USA) 520/35 हरियो डाई (AF488) र 690/70 रातो डाई (Atto647N) को लागि डिटेक्टरको अगाडि प्रयोग गरियो।एकल-फोटोन हिमस्खलन डायोड (SPAD) (माइक्रो फोटोन उपकरण, बोलजानो, इटाली) डिटेक्टरको रूपमा प्रयोग गरियो।दुवै डेटा सङ्कलन र विश्लेषण व्यावसायिक रूपमा उपलब्ध SymphoTime64 सफ्टवेयर (PicoQuant GmbH, बर्लिन, जर्मनी) को प्रयोग गरी गरिएको थियो।
एलएलपीएस नमूनाहरूको पचास माइक्रोलिटरहरू μ-स्लाइड एंजियोजेनेसिस कुवाहरूमा लागू गरियो (Ibidi GmbH, Gräfelfing, जर्मनी)।नतिजा तस्बिरहरू निलम्बित थोपाहरूका लागि इष्टतम उद्देश्य कार्य दूरीको लागि कुवाको तलबाट 20 µm मा केन्द्रित छन् र कम्तिमा 0.25 µm/पिक्सेलको अक्षीय रिजोल्युसन र 400 µs/पिक्सेलको ढिलाइ समयको साथ राफ्ट र थोप्लाहरूका लागि ~1 µm मा केन्द्रित छन्।प्रत्येक च्यानलको लागि औसत पृष्ठभूमि संकेत तीव्रता (PBG, मतलब + 2σ) मा आधारित तीव्रता थ्रेसहोल्ड लागू गरेर डेटा चयन गर्नुहोस् ताकि केवल तरल प्रोटीन थोपा, राफ्ट, वा स्पटहरू चयन गरिन्छ, फैलिएको चरणबाट कुनै पनि सम्भावित उत्पत्ति फिल्टर गर्दै।प्रत्येक च्यानलको प्रत्येक प्रजाति (τ) को आयु विश्लेषण गर्न (हरियो, AF488 को लागि "g" र रातो, Atto647N को लागि "r"), हामीले थोपा, राफ्ट, वा स्पटहरू (पूरक चित्र 1) युक्त रुचिका क्षेत्रहरू (ROIs) चयन गर्यौं। )।8b) र प्रत्येक च्यानलमा टेल-फिट विश्लेषण र दुई-कम्पोनेन्ट क्षय मोडेल प्रयोग गरेर तिनीहरूको जीवनभरको क्षय (dD, τR र τP थोपा, राफ्ट वा स्पटहरूको लागि क्रमशः, पूरक चित्र 8c हेर्नुहोस्) फिट गरेर तिनीहरूलाई व्युत्पन्न गरियो।औसत τ बाट τ।बहु-घातीय फिटको लागि धेरै थोरै फोटोनहरू उत्पादन गर्ने ROIहरूलाई विश्लेषणबाट बहिष्कृत गरियो।प्रयोग गरिएको कटअफ राफ्ट र थोप्लाहरूको लागि <104 फोटनहरू र ड्रपहरूको लागि 103 थियो।थोपाहरूको कम थ्रेसहोल्ड हुन्छ किनभने यो उच्च तीव्रता मानहरूसँग क्षय कर्भहरू प्राप्त गर्न गाह्रो हुन्छ, किनकि छवि क्षेत्रमा थोपाहरू सामान्यतया साना र कम असंख्य हुन्छन्।फोटोन सङ्कलन सीमाभन्दा माथिको फोटोन सङ्ख्या भएका ROI (>500 काउन्ट/पिक्सेलमा सेट गरिएको) पनि विश्लेषणका लागि खारेज गरियो।सबै तीव्रता क्षयको लागि समान कायम राख्दै न्यूनतम IRF हस्तक्षेप सुनिश्चित गर्न सेवा जीवनको सुरुदेखि अधिकतम (क्षयको अधिकतम तीव्रताको अलि पछि) 90% मा तीव्रताको साथ रुचिको क्षेत्रबाट प्राप्त तीव्रता क्षय वक्र मिलाउनुहोस्। सेटिङ्हरू सापेक्ष समय विन्डो राफ्ट र स्पटहरूको लागि 25 देखि 50 ROI र ड्रपहरूको लागि 15-25 ROI विश्लेषण गरियो, कम्तिमा 3 स्वतन्त्र प्रयोगहरूबाट रेकर्ड गरिएका 4 भन्दा बढी प्रतिकृतिहरूबाट चयन गरिएका छविहरू।दुई-पुच्छे टी-परीक्षणहरू प्रजातिहरू वा कोसेर्भेट प्रणालीहरू बीचको सांख्यिकीय भिन्नताहरू मूल्याङ्कन गर्न प्रयोग गरिएको छ।जीवनकाल (τ) को पिक्सेल-द्वारा-पिक्सेल विश्लेषणको लागि, प्रत्येक च्यानलको लागि फिल्डमा जीवनकालको कुल क्षीणन गणना गरिएको थियो र 2/3-घटक घातीय क्षीणन मोडेलको अनुमान गरिएको थियो।प्रत्येक पिक्सेलको लागि लाइफटाइम एटेन्युएशन त्यसपछि पहिले गणना गरिएको τ मानहरू प्रयोग गरेर फिट गरिएको थियो, परिणामस्वरूप स्यूडोकलर FLIM फिट छवि।टेल-फिट जीवनकाल दायरा एउटै च्यानलका सबै छविहरूमा समान थियो, र प्रत्येक क्षयले भरपर्दो फिट प्रदान गर्न पर्याप्त फोटोनहरू उत्पादन गर्‍यो।FRET विश्लेषणको लागि, 100 फोटोनको तल्लो तीव्रता थ्रेसहोल्ड लागू गरेर पिक्सेलहरू चयन गरिएको थियो, जसले 11 फोटनको पृष्ठभूमि संकेत (FBG) औसत गर्यो।प्रत्येक च्यानलको प्रतिदीप्तता तीव्रता प्रयोगात्मक रूपमा निर्धारित सुधार कारकहरू द्वारा सही गरिएको थियो: 69 स्पेक्ट्रल क्रसस्टक α 0.004 थियो, प्रत्यक्ष उत्तेजना β 0.0305 थियो, पत्ता लगाउने दक्षता γ 0.517 थियो।पिक्सेल स्तरमा FRET दक्षता निम्न समीकरण प्रयोग गरेर गणना गरिन्छ:
जहाँ FDD दाता (हरियो) च्यानलमा अवलोकन गरिएको फ्लोरोसेन्स तीव्रता हो, FDA अप्रत्यक्ष उत्तेजना अन्तर्गत स्वीकर्ता (रातो) च्यानलमा अवलोकन गरिएको फ्लोरोसेन्स तीव्रता हो, र FAA प्रत्यक्ष उत्तेजना (रातो) च्यानलमा अवलोकन गरिएको प्रतिदीप्तता तीव्रता हो। PIE)।प्रतिदीप्ति तीव्रता पल्स च्यानल मा अवलोकन गरिन्छ)।
LLPS बफरमा 25 µM अनलेबल गरिएको मोनोमेरिक Tau441 (25 µM αS सँग वा बिना) सहितको 100 μl LLPS प्रतिक्रिया समाधानहरू राख्नुहोस् (माथिको रूपमा पूरक) चिपकने पन्नी कोटिंग सहित गैर-बाध्यकारी 96-वेल माइक्रोप्लेटहरूमा राख्नुहोस् र माइक्रोप्लेट डब्ल्यूएफ द्वारा ड्रपलेट जाँच गरियो। सन्तुलन।10 मिनेट भित्र।कोठाको तापक्रममा इन्क्युबेशनको ४८ घण्टा पछि, प्रोटीन राफ्ट र स्पटहरूको उपस्थिति पुष्टि भयो।त्यसपछि होसियारीपूर्वक इनारहरूबाट राफ्टहरूमा तरल पदार्थ हटाउनुहोस्, त्यसपछि 50 एल डिसोसिएशन बफर (10 मिमी HEPES, pH 7.4, 1 M NaCl, 1 mM DTT) थप्नुहोस् र 10 मिनेटको लागि इन्क्युबेट गर्नुहोस्।उच्च नुन एकाग्रताले अवशिष्ट PEG को कारणले LLPS दोहोरिने छैन भन्ने सुनिश्चित गर्दछ, र इलेक्ट्रोस्टेटिक अन्तरक्रियाद्वारा मात्र गठन हुने सम्भावित प्रोटिन एसेम्बलहरू छुट्याइनेछ।इनारको तल्लो भागलाई माइक्रोपिपेट टिपको साथ सावधानीपूर्वक स्क्र्याप गरियो र नतिजाको समाधान खाली अवलोकन इनारमा स्थानान्तरण गरियो।1 घन्टाको लागि 50 μM ThT संग नमूनाहरूको इन्क्युबेशन पछि, पृथक स्पटहरूको उपस्थिति WF माइक्रोस्कोपी द्वारा जाँच गरियो।PBS मा 70-µM αS सोल्युशनको 300 μl pH 7.4, सोडियम अजाइड 0.01% 37 °C मा र 200 rpm ओर्बिटल शेकरमा 7 दिनको लागि इन्क्युबेटेड गरेर sonicated αS fibrils तयार गर्नुहोस्।समाधान त्यसपछि 30 मिनेटको लागि 9600xg मा सेन्ट्रीफ्यूज गरिएको थियो, गोली PBS pH 7.4 मा पुन: सस्पेन्ड गरिएको थियो र sonicated (1 मिनेट, 50% चक्र, 80% आयाम एक Vibra-सेल VC130 sonicator मा, Sonics, Newton, USA) fibril नमूना। साना फाइब्रिलहरूको अपेक्षाकृत समान आकारको वितरणको साथ।
FCS/FCCS विश्लेषण र दुई-रङ संयोग पत्ता लगाउने (TCCD) उही MT200 समय-समाधान गरिएको फ्लोरोसेन्ट कन्फोकल माइक्रोस्कोप (पिको-क्वान्ट, बर्लिन, जर्मनी) मा PIE मोड प्रयोग गरेर FLIM-FRET माइक्रोस्कोपी प्रयोगहरूको लागि प्रयोग गरिएको थियो।यी प्रयोगहरूको लागि लेजर पावर 6.0 µW (481 nm) र 6.2 µW (637 nm) मा थपियो।यी लेजर शक्तिहरूको संयोजन इष्टतम गणना दरहरू प्राप्त गर्दा र फोटोब्लिचिङ र संतृप्तिलाई बेवास्ता गर्दा प्रयोग गरिएको फ्लोरोफोरहरूको जोडीहरूको लागि समान चमक उत्पादन गर्न छनौट गरिएको थियो।दुवै डाटा सङ्कलन र विश्लेषण व्यावसायिक रूपमा उपलब्ध SymphoTime64 संस्करण 2.3 सफ्टवेयर (PicoQuant, Berlin, Germany) प्रयोग गरी गरिएको थियो।
LLPS प्रयोग गरेर प्राप्त पृथक αS/Tau समुच्चयका नमूनाहरू उपयुक्त मोनोमोलेक्युलर एकाग्रतामा आइसोलेसन बफरमा पातलो हुन्छन् (सामान्यतया १:५०० कमजोरी, किनकि समुच्चयहरू पहिले नै कम सांद्रतामा हुन्छन् जब कोसेर्भेट नमूनाहरूबाट अलग गरिन्छ)।नमूनाहरू 1 mg/mL को एकाग्रतामा BSA समाधानको साथ प्रिकोटेड कभरस्लिप्स (कोर्निङ, संयुक्त राज्य अमेरिका) मा सीधा लागू गरियो।
हरियो र रातो च्यानलहरूमा PIE-smFRET विश्लेषणको लागि, मोनोमेरिक घटनाहरूको कारणले गर्दा कम तीव्रता संकेतहरू फिल्टर गर्न 25 फोटोनको कम तीव्रता थ्रेसहोल्ड लागू गरिएको थियो (ध्यान दिनुहोस् कि पृथक समुच्चयहरूको तुलनामा मोनोमरहरू एकत्रित नमूनाहरू भन्दा बढी छन्)।यस थ्रेसहोल्डलाई शुद्ध मोनोमर नमूनाहरूको विश्लेषणबाट प्राप्त गरिएको मोनोमेरिक αS को औसत तीव्रताको पाँच गुणाको रूपमा गणना गरिएको थियो ताकि विश्लेषणको लागि विशेष रूपमा समुच्चयहरू चयन गर्नुहोस्।PIE ड्राइभ सर्किट, TSCPC डाटा अधिग्रहणको साथमा, पृष्ठभूमि र वर्णक्रमीय क्रसस्टक हटाउन मद्दत गर्ने जीवनभर वजन फिल्टरको अनुप्रयोगलाई सक्षम पारेको छ।माथिको थ्रेसहोल्डहरू प्रयोग गरेर चयन गरिएको फ्लेयर तीव्रतालाई बफर-मात्र नमूनाहरूको तीव्रता/बिन बनाम घटनाको हिस्टोग्रामबाट निर्धारण गरिएको औसत पृष्ठभूमि संकेत प्रयोग गरेर सच्याइयो।ठूला समुच्चयहरूसँग सम्बन्धित बर्स्टहरू सामान्यतया टाइम ट्रेस (1 ms मा सेट) मा लगातार धेरै बिनहरू ओगट्छन्।यी अवस्थाहरूमा, अधिकतम शक्तिको बिन छनोट गरिएको थियो।FRET र stoichiometric विश्लेषणको लागि, सैद्धान्तिक रूपमा निर्धारित गामा कारक γ (0.517) प्रयोग गरिएको थियो।स्पेक्ट्रल क्रसस्टक र प्रत्यक्ष उत्तेजना योगदानहरू नगण्य छन् (प्रयोगात्मक रूपमा निर्धारित) उत्तेजना लेजर पावर प्रयोगमा।एक विस्फोट मा FRET को दक्षता र stoichiometry निम्नानुसार गणना गरिन्छ।