304 स्टेनलेस स्टील वेल्डेड कुंडलित ट्यूब / ट्युबिंग जेमिकल जोम्पोनेन्ट, ग्लोबल समुद्री माइक्रोबायोमको बायोसिंथेटिक क्षमता

Nature.com भ्रमण गर्नुभएकोमा धन्यवाद।तपाईं सीमित CSS समर्थनको साथ ब्राउजर संस्करण प्रयोग गर्दै हुनुहुन्छ।उत्तम अनुभवको लागि, हामी तपाईंलाई अपडेट गरिएको ब्राउजर प्रयोग गर्न सिफारिस गर्छौं (वा इन्टरनेट एक्सप्लोररमा अनुकूलता मोड असक्षम गर्नुहोस्)।थप रूपमा, निरन्तर समर्थन सुनिश्चित गर्न, हामी शैलीहरू र जाभास्क्रिप्ट बिना साइट देखाउँछौं।
स्लाइडरहरू प्रति स्लाइड तीन लेखहरू देखाउँदै।स्लाइडहरू मार्फत सार्नको लागि पछाडि र अर्को बटनहरू प्रयोग गर्नुहोस्, वा प्रत्येक स्लाइडमा सार्नको लागि अन्तमा स्लाइड नियन्त्रक बटनहरू प्रयोग गर्नुहोस्।

विस्तृत उत्पादन विवरण

304 स्टेनलेस स्टील वेल्डेड कोइल गरिएको ट्यूब / ट्युबिंग
1. विशिष्टता: स्टेनलेस स्टील कोइल ट्यूब / ट्युबिङ
2. प्रकार: वेल्डेड वा सिमलेस
3. मानक: ASTM A269, ASTM A249
4. स्टेनलेस स्टील कोइल ट्यूब OD: 6mm देखि 25.4MM सम्म
5. लम्बाइ: 600-3500MM वा ग्राहकको आवश्यकता अनुसार।
6. पर्खाल मोटाई: 0.2mm देखि 2.0mm।

7. सहिष्णुता: OD: +/-0.01mm;मोटाई: +/-0.01%।

8. कुंडल भित्री प्वाल आकार: 500MM-1500MM (ग्राहक आवश्यकता अनुसार समायोजित गर्न सकिन्छ)

9. कुंडल उचाइ: 200MM-400MM (ग्राहक आवश्यकता अनुसार समायोजित गर्न सकिन्छ)

10. सतह: उज्यालो वा annealed
11. सामग्री: 304, 304L, 316L, 321, 301, 201, 202, 409, 430, 410, मिश्र धातु 625, 825, 2205, 2507, आदि।
12. प्याकिङ: काठको केसमा बुनेको झोला, काठको प्यालेट, काठको शाफ्ट, वा ग्राहकको आवश्यकता अनुसार
13. परीक्षण: रासायनिक घटक, उपज शक्ति, तन्य शक्ति, कठोरता मापन
14. ग्यारेन्टी: तेस्रो पक्ष (उदाहरणका लागि: SGS TV) निरीक्षण, आदि।
15. आवेदन: सजावट, फर्निचर, तेल ढुवानी, गर्मी एक्सचेन्जर, रेलिङ बनाउने, कागज बनाउने, अटोमोबाइल, खाद्य प्रशोधन, चिकित्सा, आदि।

प्राकृतिक माइक्रोबियल समुदायहरू phylogenetically र metabolically विविध छन्।जीवहरूको अध्यन गरिएका समूहहरू बाहेक, यो विविधताले पारिस्थितिक र जैव-प्रौद्योगिक रूपमा महत्त्वपूर्ण इन्जाइमहरू र जैव रासायनिक यौगिकहरू 2,3 को आविष्कारको लागि प्रशस्त सम्भावना पनि राख्छ।यद्यपि, यस विविधताको अध्ययन गर्ने जीनोमिक मार्गहरू निर्धारण गर्न जुन त्यस्ता यौगिकहरूलाई संश्लेषण गर्दछ र तिनीहरूलाई सम्बन्धित होस्टहरूमा बाँध्छ।विश्वव्यापी स्तरमा सम्पूर्ण जीनोम रिजोलुसन डेटाको विश्लेषणमा सीमितताहरूको कारण खुला समुद्रमा सूक्ष्मजीवहरूको जैविक संश्लेषण क्षमता धेरै हदसम्म अज्ञात छ।यहाँ, हामीले 1,000 भन्दा बढी समुद्री पानीका नमूनाहरूबाट 25,000 भन्दा बढी नयाँ पुनर्गठित ड्राफ्ट जीनोमहरूका साथ संवर्धित कक्षहरू र एकल कक्षहरूबाट लगभग 10,000 माइक्रोबियल जीनोमहरू एकीकृत गरेर समुद्रमा बायोसिंथेटिक जीन क्लस्टरहरूको विविधता र विविधताको अन्वेषण गर्छौं।यी प्रयासहरूले लगभग 40,000 पुटेटिभ धेरै जसो नयाँ बायोसिंथेटिक जीन क्लस्टरहरू पहिचान गरेका छन्, जसमध्ये केही पहिले अस्पष्ट फाइलोजेनेटिक समूहहरूमा फेला परेका छन्।यी जनसङ्ख्याहरूमा, हामीले बायोसिंथेटिक जीन क्लस्टरहरू ("क्यान्डिडेटस युडोर्माइक्रोबियासी") मा समृद्ध एक वंश पहिचान गर्‍यौं जुन एक अव्यवस्थित ब्याक्टेरियल फिलमसँग सम्बन्धित थियो र यस वातावरणमा केही जैविक संश्लेषक रूपमा विविध सूक्ष्मजीवहरू समावेश थिए।यी मध्ये, हामीले क्रमशः असामान्य बायोएक्टिभ यौगिक संरचना र इन्जाइमोलजीको उदाहरणहरू पहिचान गर्दै, फास्फेट-पेप्टाइड र पाइटोनामाइड मार्गहरू चित्रण गरेका छौं।निष्कर्षमा, यो अध्ययनले कसरी माइक्रोबायोममा आधारित रणनीतिहरूले खराब रूपमा बुझिएको माइक्रोबायोटा र वातावरणमा पहिले वर्णन नगरिएका इन्जाइमहरू र प्राकृतिक खाद्य पदार्थहरूको अन्वेषणलाई सक्षम पार्न सक्छ भनेर देखाउँछ।
सूक्ष्मजीवहरूले विश्वव्यापी जैव-रासायनिक चक्रहरू चलाउँछन्, खानाको जालहरू कायम राख्छन्, र बोटबिरुवा र जनावरहरूलाई स्वस्थ राख्छन्5।तिनीहरूको विशाल फाइलोजेनेटिक, मेटाबोलिक र कार्यात्मक विविधताले प्राकृतिक उत्पादनहरू सहित नयाँ taxa1, इन्जाइमहरू र बायोकेमिकल यौगिकहरूको खोजको लागि समृद्ध सम्भावना प्रतिनिधित्व गर्दछ।पारिस्थितिक समुदायहरूमा, यी अणुहरूले विभिन्न प्रकारका शारीरिक र पारिस्थितिक कार्यहरू प्रदान गर्छन्, संचारदेखि प्रतिस्पर्धासम्म 2, 7।तिनीहरूको मौलिक कार्यहरू बाहेक, यी प्राकृतिक उत्पादनहरू र तिनीहरूको आनुवंशिक रूपमा कोड गरिएको उत्पादन मार्गहरूले बायोटेक्नोलोजिकल र चिकित्सीय अनुप्रयोगहरू २,३ को लागि उदाहरणहरू प्रदान गर्दछ।त्यस्ता मार्गहरू र जडानहरूको पहिचानलाई संवर्धित सूक्ष्मजीवहरूको अध्ययनले धेरै सहज बनाएको छ।यद्यपि, प्राकृतिक वातावरणको वर्गीकरण अध्ययनले धेरैजसो सूक्ष्मजीवहरूको खेती नगरेको देखाएको छ।यो सांस्कृतिक पूर्वाग्रहले धेरै सूक्ष्मजीवहरू 4,9 द्वारा इन्कोड गरिएको कार्यात्मक विविधताको शोषण गर्ने हाम्रो क्षमतालाई सीमित गर्दछ।
यी सीमितताहरू पार गर्न, गत दशकमा प्राविधिक विकासहरूले अनुसन्धानकर्ताहरूलाई सम्पूर्ण समुदायहरू (मेटाजेनोमिक्स) वा एकल कक्षहरूबाट प्रत्यक्ष रूपमा (अर्थात, पूर्व संस्कृति बिना) माइक्रोबियल डीएनए टुक्राहरू अनुक्रम गर्न अनुमति दिएको छ।यी टुक्राहरूलाई ठूला जीनोम टुक्राहरूमा भेला गर्ने र क्रमशः बहु मेटाजेनोमिकली एसेम्बल गरिएको जीनोमहरू (MAGs) वा एकल एम्प्लीफाइड जीनोमहरू (SAGs) को पुन: निर्माण गर्ने क्षमताले माइक्रोबायोम (जस्तै, माइक्रोबियल समुदायहरू र माइक्रोबायोम) को कर केन्द्रित अध्ययनको लागि महत्त्वपूर्ण अवसर खोल्छ।नयाँ मार्ग प्रशस्त।दिइएको वातावरणमा आफ्नै आनुवंशिक सामग्री) 10,11,12।वास्तवमा, भर्खरैका अध्ययनहरूले Earth1, 13 मा माइक्रोबियल विविधताको फाइलोजेनेटिक प्रतिनिधित्वलाई धेरै विस्तार गरेको छ र व्यक्तिगत माइक्रोबियल समुदायहरूमा धेरै कार्यात्मक विविधता प्रकट गरेको छ जुन पहिले सुसंस्कृत सूक्ष्मजीव सन्दर्भ जीनोम अनुक्रम (REFs) 14 द्वारा कभर गरिएको थिएन।होस्ट जीनोम (जस्तै, जीनोम रिजोल्युसन) को सन्दर्भमा पत्ता नलागेको कार्यात्मक विविधता राख्ने क्षमता अझै पनि अपरिचित माइक्रोबियल लाइनहरू भविष्यवाणी गर्नको लागि महत्त्वपूर्ण छ जुन सम्भवतः नयाँ प्राकृतिक उत्पादनहरू 15,16 इनकोड गर्दछ वा त्यस्ता यौगिकहरूलाई तिनीहरूको मूल उत्पादकमा फिर्ता ट्रेस गर्नको लागि।उदाहरणका लागि, संयुक्त मेटाजेनोमिक र एकल-सेल जीनोमिक विश्लेषण दृष्टिकोणले विभिन्न प्रकारका औषधि सम्भाव्यताका उत्पादकहरूको रूपमा मेटाबोलिक रूपमा समृद्ध स्पन्ज-सम्बन्धित ब्याक्टेरियाहरूको समूह, Candidatus Entotheonella को पहिचान गर्न नेतृत्व गरेको छ।यद्यपि, विभिन्न माइक्रोबियल समुदायहरूको जीनोमिक अन्वेषणमा हालैका प्रयासहरूको बावजुद, 16,19 पृथ्वीको सबैभन्दा ठूलो पारिस्थितिकी महासागरको लागि विश्वव्यापी मेटाजेनोमिक डेटाको दुई तिहाइ भन्दा बढी 16,20 अझै हराइरहेको छ।तसर्थ, सामान्यतया, समुद्री माइक्रोबायोमको बायोसिंथेटिक क्षमता र उपन्यास इन्जाइम्याटिक र प्राकृतिक उत्पादनहरूको भण्डारको रूपमा यसको सम्भावना धेरै हदसम्म कम छ।
विश्वव्यापी स्तरमा समुद्री माइक्रोबायोमहरूको बायोसिंथेटिक क्षमता अन्वेषण गर्न, हामीले पहिलो पटक संस्कृति-निर्भर र गैर-संस्कृति विधिहरू प्रयोग गरेर प्राप्त समुद्री माइक्रोबियल जीनोमहरू जम्मा गर्यौं।यस डाटाबेसको परीक्षणले बायोसिंथेटिक जीन क्लस्टरहरू (BGCs) को एक विस्तृत विविधता प्रकट गर्‍यो, जसमध्ये धेरै जसो अझै अज्ञात जीन क्लस्टर (GCF) परिवारहरूसँग सम्बन्धित छन्।थप रूपमा, हामीले एक अज्ञात ब्याक्टेरिया परिवार पहिचान गर्यौं जसले आजसम्म खुला समुद्रमा BGCs को उच्चतम ज्ञात विविधता प्रदर्शन गर्दछ।हामीले दुई रिबोसोमल संश्लेषण र पोस्ट-ट्रान्सलेसनली परिमार्जित पेप्टाइड (RiPP) मार्गहरू प्रयोगात्मक प्रमाणीकरणको लागि हालको ज्ञात मार्गहरूबाट तिनीहरूको आनुवंशिक भिन्नताहरूको आधारमा चयन गर्यौं।यी मार्गहरूको कार्यात्मक विशेषताले इन्जाइमोलजीको अप्रत्याशित उदाहरणहरू साथै प्रोटीज अवरोध गतिविधिको साथ संरचनात्मक रूपमा असामान्य यौगिकहरू प्रकट गरेको छ।
सुरुमा, हामीले यसको ब्याक्टेरिया र पुरातात्विक कम्पोनेन्टहरूमा ध्यान केन्द्रित गर्दै, जीनोम विश्लेषणको लागि विश्वव्यापी डेटा स्रोत सिर्जना गर्ने लक्ष्य राख्यौं।यस उद्देश्यका लागि, हामीले 215 विश्वव्यापी रूपमा वितरित नमूना साइटहरू (अक्षांश दायरा = 141.6°) र धेरै गहिरो तहहरू (1 देखि 5600 मिटर गहिराइमा, pelagic, mesopelagic र abissal zone लाई ढाक्ने) बाट मेटाजेनोमिक डेटा र 1038 समुद्री पानीका नमूनाहरू जम्मा गर्यौं।पृष्ठभूमि21,22,23 (चित्र 1a, विस्तारित डेटा, चित्र 1a र पूरक तालिका 1)।फराकिलो भौगोलिक कभरेज प्रदान गर्नुको अतिरिक्त, यी छानिएका फिल्टर गरिएका नमूनाहरूले हामीलाई भाइरस-धनी (<0.2 µm), प्रोकारियोटिक-रिच (0.2-3 µm), कण-धनी (0.8 µm) सहित समुद्री माइक्रोबायोमका विभिन्न घटकहरू तुलना गर्न अनुमति दिए। )।-20 µm) र भाइरस-क्षय (>0.2 µm) उपनिवेशहरू।
a, कुल 1038 सार्वजनिक रूपमा उपलब्ध जीनोमहरू (मेटाजेनोमिक्स) समुद्री माइक्रोबियल समुदायहरूको 215 विश्वव्यापी रूपमा वितरित स्थानहरू (62°S देखि 79°N र 179°W देखि 179°E) बाट सङ्कलन गरियो।नक्सा टाइल्स © Esri।स्रोतहरू: GEBCO, NOAA, CHS, OSU, UNH, CSUMB, National Geographic, DeLorme, NAVTEQ, र Esri।b, यी मेटाजेनोमहरू MAGs (विधिहरू र थप जानकारी) को पुन: निर्माण गर्न प्रयोग गरियो, जुन डेटासेटहरूमा (रङमा चिन्ह लगाइएको) मा मात्रा र गुणस्तर (विधिहरू) मा भिन्न हुन्छ।पुनर्गठित MAGs सार्वजनिक रूपमा उपलब्ध (बाह्य) जीनोमहरू, हस्तशिल्प MAG26, SAG27 र REF सहित पूरक थिए।27 OMD कम्पाइल गर्नुहोस्।ग, SAG (GORG)20 वा MAG (GEM)16 मा आधारित अघिल्लो रिपोर्टहरूको तुलनामा, OMD ले समुद्री माइक्रोबियल समुदायहरूको जीनोमिक विशेषतालाई सुधार गर्दछ (मेटाजेनोमिक रिड म्यापिङ दर; विधि) गहिराईमा अझ लगातार प्रतिनिधित्वको साथ दुई देखि तीन गुणाले सुधार गर्दछ। अक्षांश।।<0.2, n=151, 0.2-0.8, n=67, 0.2-3, n=180, 0.8-20, n=30, >0.2, n=610, <30°, n = 132, 30–60° , n = 73, >60°, n = 42, EPI, n = 174, MES, n = 45, BAT, n = 28। d, OMD को प्रजाति क्लस्टर स्तरमा समूहीकरण (95% मतलब न्यूक्लियोटाइड पहिचान) कुल पहिचान गर्दछ लगभग 8300 प्रजातिहरू, जसमध्ये आधा भन्दा बढी GTDB (संस्करण 89) e प्रयोग गरी वर्गीकरण एनोटेसनहरू अनुसार वर्णित गरिएको थिएन, जीनोम प्रकारद्वारा प्रजातिहरूको वर्गीकरणले MAG, SAG र REFs को फाइलोजेनेटिक विविधता प्रतिबिम्बित गर्न एकअर्कालाई राम्रोसँग पूरक भएको देखाएको छ। समुद्री माइक्रोबायोम।विशेष गरी, 55%, 26% र 11% प्रजाति क्रमशः MAG, SAG र REF को लागि विशिष्ट थिए।BATS, बर्मुडा एट्लान्टिक समय श्रृंखला;GEM, पृथ्वीको माइक्रोबायोमको जीनोम;GORG, वैश्विक महासागर सन्दर्भ जीनोम;HOT, हवाई महासागर समय श्रृंखला।
यो डेटासेट प्रयोग गरेर, हामीले कुल 26,293 MAGs को पुनर्निर्माण गर्यौं, प्रायः ब्याक्टेरिया र पुरातात्विक (चित्र 1b र विस्तारित डेटा, चित्र 1b)।हामीले यी MAG हरू विभिन्न स्थानहरू वा समय बिन्दुहरू (विधिहरू) बाट नमूनाहरू बीचको प्राकृतिक अनुक्रम भिन्नताको पतन रोक्नको लागि पूल गरिएको मेटाजेनोमिक नमूनाहरूको सट्टा छुट्टै सम्मेलनहरूबाट सिर्जना गर्यौं।थप रूपमा, हामीले जीनोमिक टुक्राहरूलाई ठूलो संख्यामा नमूनाहरू (58 देखि 610 नमूनाहरू, सर्वेक्षणमा निर्भर गर्दै; विधि) मा तिनीहरूको प्रसार सहसंबंधको आधारमा समूहबद्ध गर्यौं।हामीले फेला पार्‍यौं कि यो समय-उपभोग गर्ने तर महत्त्वपूर्ण चरण24 हो जुन धेरै ठूला-ठूला MAG16, 19, 25 पुनर्निर्माण कार्यहरूमा छोडिएको थियो र यसले मात्रा (औसतमा 2.7-गुना) र गुणस्तर (औसतमा +20%) मा उल्लेखनीय सुधार गर्दछ। जीनोम।यहाँ अध्ययन गरिएको समुद्री मेटाजेनोमबाट पुनर्निर्माण गरिएको (विस्तारित डेटा, चित्र 2a र थप जानकारी)।समग्रमा, यी प्रयासहरूले आज उपलब्ध सबैभन्दा व्यापक MAG संसाधनको तुलनामा समुद्री माइक्रोबियल MAGs मा 4.5-गुणा वृद्धि (उच्च-गुणस्तर MAGs मात्र मानिन्छ भने 6-गुणा) मा परिणत भएको छ (विधिहरू)।यो नयाँ सिर्जना गरिएको MAG सेटलाई त्यसपछि 830 ह्यान्ड-पिक्ड MAG26s, 5969 SAG27s र 1707 REFs सँग जोडिएको थियो।२७ प्रजातिका समुद्री ब्याक्टेरिया र पुरातत्वले ३४,७९९ जीनोमहरूको संयुक्त संग्रह बनाउँछ (चित्र १b)।
त्यसपछि हामीले समुद्री माइक्रोबियल समुदायहरूको प्रतिनिधित्व गर्ने क्षमतामा सुधार गर्न र विभिन्न जीनोम प्रकारहरू एकीकृत गर्दा प्रभावको मूल्याङ्कन गर्न नयाँ सिर्जना गरिएको स्रोतको मूल्याङ्कन गर्‍यौं।औसतमा, हामीले फेला पारेको छ कि यसले समुद्री मेटाजेनोमिक डेटा (चित्र 1c) को लगभग 40-60% कभर गर्दछ, गहिराइ र अक्षांश दुवैमा अघिल्लो MAG-मात्र रिपोर्टहरूको कभरेज भन्दा दुई देखि तीन गुणा More serial 16 वा SAG20।थप रूपमा, व्यवस्थित रूपमा स्थापित संग्रहहरूमा वर्गीकरण विविधता मापन गर्न, हामीले जेनोम ट्याक्सोनोमी डाटाबेस (GTDB) टूलकिट (विधिहरू) प्रयोग गरेर सबै जीनोमहरू एनोटेट गर्यौं र 95% को औसत जीनोम-वाइड न्यूक्लियोटाइड पहिचान प्रयोग गर्‍यौं।28 8,304 प्रजाति क्लस्टर (प्रजाति) पहिचान गर्न।यी प्रजातिहरूको दुई तिहाइ (नयाँ क्लेडहरू सहित) पहिले GTDB मा देखा परेका थिएनन्, जसमध्ये 2790 यस अध्ययनमा पुनर्निर्माण गरिएको MAG प्रयोग गरेर पत्ता लगाइएका थिए (चित्र 1d)।थप रूपमा, हामीले विभिन्न प्रकारका जीनोमहरू अत्यधिक पूरक छन्: 55%, 26%, र 11% प्रजातिहरू क्रमशः MAG, SAG, र REF बाट बनेका छन् (चित्र 1e)।थप रूपमा, MAG ले पानी स्तम्भमा पाइने सबै 49 प्रकारहरू समेट्यो, जबकि SAG र REF ले क्रमशः 18 र 11 लाई मात्र प्रतिनिधित्व गर्यो।यद्यपि, SAG ले सबैभन्दा सामान्य क्लेडहरू (विस्तारित डेटा, चित्र 3a) को विविधतालाई राम्रोसँग प्रतिनिधित्व गर्दछ, जस्तै Pelagic Bacteriales (SAR11), SAG ले लगभग 1300 प्रजातिहरू र MAG मात्र 390 प्रजातिहरू समावेश गर्दछ।उल्लेखनीय रूपमा, REF हरू विरलै प्रजाति स्तरमा MAGs वा SAGs सँग ओभरल्याप हुन्छन् र यहाँ अध्ययन गरिएका खुला सागर मेटाजेनोमिक सेटहरूमा नभेटिएका लगभग 1000 जीनोमहरूको > 95% प्रतिनिधित्व गर्दछ, मुख्यतया अन्य प्रकारका पृथक प्रतिनिधि समुद्री नमूनाहरूसँग अन्तरक्रियाको कारणले (उदाहरणका लागि तलछटहरू)। ।वा होस्ट-सहयोगी)।यसलाई वैज्ञानिक समुदायमा व्यापक रूपमा उपलब्ध गराउनको लागि, यो समुद्री जीनोम संसाधन, जसमा अवर्गीकृत टुक्राहरू पनि समावेश छन् (उदाहरणका लागि, भविष्यवाणी गरिएका फेजहरू, जीनोमिक टापुहरू, र जीनोम टुक्राहरू जसका लागि MAG पुनर्निर्माणको लागि अपर्याप्त डाटा छ), वर्गीकरण डेटासँग तुलना गर्न सकिन्छ। ।ओशन माइक्रोबायोलोजी डाटाबेस (OMD; https://microbiomics.io/ocean/) मा जीन प्रकार्य र प्रासंगिक प्यारामिटरहरूको साथ एनोटेसनहरू पहुँच गर्नुहोस्।
त्यसपछि हामी खुला महासागर माइक्रोबायोमहरूमा बायोसिंथेटिक क्षमताको समृद्धि र नवीनता अन्वेषण गर्न निस्क्यौं।यस अन्तको लागि, हामीले पहिलो पटक 39,055 BGCs को भविष्यवाणी गर्न 1038 समुद्री मेटाजेनोम (विधिहरू) मा पाइने सबै MAGs, SAGs, र REFs को लागि antiSMASH प्रयोग गर्यौं।हामीले यसलाई 6907 गैर-रिडन्डन्ट GCF र 151 जीन क्लस्टर जनसंख्या (GCCs; पूरक तालिका 2 र विधिहरू) मा अन्तर्निहित रिडन्डन्सी (अर्थात्, एउटै BGC बहु ​​जीनोमहरूमा इन्कोड गर्न सकिन्छ) र केन्द्रित BGC को मेटाजेनोमिक डेटा फ्र्याग्मेन्टेशनको लागि समूहबद्ध गर्यौं।अपूर्ण BGCs ले उल्लेखनीय रूपमा वृद्धि भएको छैन, यदि कुनै भएमा (पूरक जानकारी), क्रमशः GCF र GCC को संख्या, 44% र 86% केसहरूमा कम्तिमा एक अक्षुण्ण BGC सदस्य रहेको।
GCC स्तरमा, हामीले भविष्यवाणी गरिएका RiPPs र अन्य प्राकृतिक उत्पादनहरू (चित्र 2a) को एक विस्तृत विविधता भेट्टायौं।तिनीहरूमध्ये, उदाहरणका लागि, एरिल्पोलिनेस, क्यारोटिनोइड्स, इक्टोइन्स, र साइडरोफोरहरू GCC सँग सम्बन्धित छन् जसमा फराकिलो फाइलोजेनेटिक वितरण र समुद्री मेटाजेनोमहरूमा उच्च प्रचुरता हुन्छ, जसले प्रतिक्रियाशील स्पेसिजेन प्रतिरोध सहित समुद्री वातावरणमा सूक्ष्मजीवहरूको व्यापक अनुकूलनलाई संकेत गर्न सक्छ। अक्सिडेटिभ र ओस्मोटिक तनाव।।वा फलाम अवशोषण (थप जानकारी)।यो कार्यात्मक विविधता NCBI RefSeq डाटाबेस (BiG-FAM/RefSeq, पछि RefSeq भनेर उल्लेख गरिएको) मा भण्डारण गरिएका लगभग 190,000 जीनोमहरू मध्ये लगभग 1.2 मिलियन BGCs को हालैको विश्लेषणसँग विपरित छ। ide संश्लेषण (PKS) BGCs (पूरक जानकारी)।हामीले 44 (29%) GCC हरू कुनै पनि RefSeq BGC (\(\bar{d}\) RefSeq > 0.4; चित्र 2a र विधिहरू) र 53 (35%) GCC हरू MAG मा मात्रै सम्भाव्यतालाई हाइलाइट गर्दै टाढासँग सम्बन्धित भेट्टायौं। OMD मा पहिले अज्ञात रसायनहरू पत्ता लगाउन।यी प्रत्येक GCC ले सम्भावित रूपमा धेरै विविध बायोसिंथेटिक कार्यहरू प्रतिनिधित्व गर्दछ भन्ने कुरालाई ध्यानमा राख्दै, हामीले समान प्राकृतिक उत्पादनहरूका लागि कोडको लागि भविष्यवाणी गरिएको BGCs को थप विस्तृत समूह प्रदान गर्ने प्रयासमा GCF स्तरमा डेटाको थप विश्लेषण गर्यौं।कुल 3861 (56%) पहिचान गरिएका GCF हरू RefSeq सँग ओभरल्याप भएनन्, र >97% GCF हरू MIBiG मा उपस्थित थिएनन्, प्रयोगात्मक रूपमा मान्य BGCs (चित्र 2b) को सबैभन्दा ठूलो डाटाबेसहरू मध्ये एक।सन्दर्भ जीनोमले राम्रोसँग प्रतिनिधित्व नगर्ने सेटिङहरूमा धेरै सम्भावित उपन्यास मार्गहरू पत्ता लगाउनु अचम्मको कुरा होइन, बेन्चमार्किङ अघि BGCs लाई GCF मा विच्छेद गर्ने हाम्रो विधि अघिल्लो रिपोर्टहरू 16 भन्दा फरक छ र हामीलाई नवीनताको निष्पक्ष मूल्याङ्कन प्रदान गर्न अनुमति दिन्छ।धेरै जसो नयाँ विविधता (3012 GCF वा 78%) अनुमानित टर्पेनेस, RiPP वा अन्य प्राकृतिक उत्पादनहरूसँग मेल खान्छ, र धेरैजसो (1815 GCF वा 47%) तिनीहरूको बायोसिंथेटिक क्षमताको कारणले अज्ञात प्रकारहरूमा इन्कोड गरिएको छ।PKS र NRPS क्लस्टरहरूको विपरीत, यी कम्प्याक्ट BGC हरू मेटाजेनोमिक असेम्ब्ली 31 को समयमा खण्डित हुने सम्भावना कम हुन्छ र तिनीहरूका उत्पादनहरूको अधिक समय- र स्रोत-गहन कार्यात्मक विशेषताहरूलाई अनुमति दिन्छ।
कुल 39,055 BGCs लाई 6,907 GCF र 151 GCC मा समूहबद्ध गरिएको थियो।a, डाटा प्रतिनिधित्व (आन्तरिक बाह्य)।GCC मा आधारित BGC दूरीहरूको पदानुक्रमिक क्लस्टरिङ, जसमध्ये 53 MAG द्वारा मात्र तय गरिएको छ।GCC ले विभिन्न taxa (ln-रूपान्तरित गेट फ्रिक्वेन्सी) र विभिन्न BGC वर्गहरू (सर्कल साइज यसको फ्रिक्वेन्सीसँग मेल खान्छ) BGC हरू समावेश गर्दछ।प्रत्येक GCC को लागि, बाहिरी तहले BGC को संख्या, व्यापकता (नमूनाहरूको प्रतिशत), र दूरी (न्यूनतम BGC कोसाइन दूरी (min(dMIBiG))) BiG-FAM देखि BGC सम्मको प्रतिनिधित्व गर्दछ।BGC हरू प्रयोगात्मक रूपमा प्रमाणित BGCs (MIBiG) सँग नजिकको सम्बन्ध भएका GCCहरूलाई तीरहरूद्वारा हाइलाइट गरिएको छ।b अनुमानित (BiG-FAM) र प्रयोगात्मक रूपमा मान्य (MIBiG) BGCs सँग GCF तुलना गर्दा, 3861 नयाँ (d–>0.2) GCF फेला पर्‍यो।RiPP, terpenes, र अन्य putative प्राकृतिक उत्पादनहरु को लागी यी कोड को धेरै (78%)।c, 1038 समुद्री मेटाजेनोमहरूमा पाइने OMD मा सबै जीनोमहरू OMD को फाइलोजेनेटिक कभरेज देखाउन GTDB आधार रूखमा राखिएको थियो।OMD मा कुनै पनि जीनोम बिना क्लेडहरू खैरो रंगमा देखाइन्छ।BGC को संख्या दिइएको क्लेडमा प्रति जीनोम अनुमानित BGC हरूको सबैभन्दा ठूलो संख्यासँग मेल खान्छ।स्पष्टताको लागि, अन्तिम 15% नोडहरू पतन भएका छन्।तीरहरूले माइकोब्याक्टेरियम, गोर्डोनिया (रोडोकोकसमा दोस्रो), र क्रोकोस्फेरा (सिनेकोकोकसको दोस्रो मात्र) को अपवाद बाहेक BGC (>15 BGC) मा धनी क्लेडहरू संकेत गर्दछ।d, अज्ञात c।Eremiobacterota ले उच्चतम बायोसिंथेटिक विविधता देखायो (प्राकृतिक उत्पादन प्रकार मा आधारित श्यानन सूचकांक)।प्रत्येक ब्यान्डले प्रजातिहरूमा सबैभन्दा धेरै BGCs भएको जीनोमलाई प्रतिनिधित्व गर्दछ।T1PKS, PKS प्रकार I, T2/3PKS, PKS प्रकार II र प्रकार III।
समृद्धि र नवीनताको अतिरिक्त, हामी समुद्री माइक्रोबायोमको बायोसिंथेटिक क्षमताको जैविक भौगोलिक संरचना अन्वेषण गर्छौं।औसत मेटाजेनोमिक GCF प्रतिलिपि संख्या वितरण (विधि) द्वारा नमूनाहरूको समूहीकरणले देखाएको छ कि कम-अक्षांश, सतह, प्रोकारियोटिक-धनी र भाइरस-गरीब समुदायहरू, प्रायः सतह वा गहिरो सूर्यलाइट पानीबाट, RiPP र BGC terpenes मा धनी थिए।यसको विपरित, ध्रुवीय, गहिरो-समुद्र, भाइरस- र कण-धनी समुदायहरू NRPS र PKS BGC (विस्तारित डेटा, चित्र 4 र थप जानकारी) को उच्च प्रचुरतासँग सम्बन्धित थिए।अन्तमा, हामीले राम्रोसँग अध्ययन गरिएका उष्णकटिबंधीय र पेलाजिक समुदायहरू नयाँ टेर्पेनेस (संवर्धित डेटा चित्र) को सबैभन्दा आशाजनक स्रोतहरू हुन् भन्ने फेला पार्यौं।PKS, RiPP र अन्य प्राकृतिक उत्पादनहरूको लागि उच्चतम क्षमता (विस्तारित डाटाको साथ चित्र 5a)।
समुद्री माइक्रोबायोमहरूको बायोसिंथेटिक क्षमताको हाम्रो अध्ययनलाई पूरक बनाउन, हामीले तिनीहरूको फाइलोजेनेटिक वितरणलाई नक्सा गर्ने र नयाँ BGC-समृद्ध क्लेडहरू पहिचान गर्ने लक्ष्य राख्यौं।यसका लागि, हामीले समुद्री जीवाणुहरूको जीनोमहरूलाई सामान्यीकृत GTDB13 ब्याक्टेरिया र पुरातात्विक फाइलोजेनेटिक रूखमा राख्यौं र तिनीहरूले सङ्केत गर्ने पुटेटिभ बायोसिंथेटिक मार्गहरू ओभरलेयौं (चित्र 2c)।हामीले सजिलैसँग धेरै BGC-समृद्ध क्लेडहरू फेला पारेका छौं (15 BGCs द्वारा प्रतिनिधित्व गरिएको) समुद्री पानीको नमूनाहरू (विधिहरू) मा तिनीहरूको बायोसिंथेटिक क्षमताका लागि परिचित, जस्तै साइनोब्याक्टेरिया (Synechococcus) र Proteus ब्याक्टेरिया, जस्तै Tistrella32,33, वा हालसालै तिनीहरूको लागि ध्यान आकर्षित गरिएको छ। प्राकृतिक उत्पादनहरु।जस्तै Myxococcota (Sandaracinaceae), Rhodococcus र Planctomycetota34,35,36।चाखलाग्दो कुरा के छ भने, हामीले यी क्लेडहरूमा धेरै पहिले अनपेक्षित वंशहरू भेट्टायौं।उदाहरणका लागि, फाइला प्लान्क्टोमाइसेटोटा र माइक्सोकोकोटामा सबैभन्दा धनी जैविक संश्लेषण क्षमता भएका ती प्रजातिहरू क्रमशः अज्ञात उम्मेद्वार अर्डर र जेनेराका थिए (पूरक तालिका ३)।सँगै लिएर, यसले सुझाव दिन्छ कि OMD ले पहिलेको अज्ञात फाइलोजेनेटिक जानकारीमा पहुँच प्रदान गर्दछ, सूक्ष्मजीवहरू सहित, जसले इन्जाइम र प्राकृतिक उत्पादन खोजका लागि नयाँ लक्ष्यहरू प्रतिनिधित्व गर्न सक्छ।
अर्को, हामीले BGC-समृद्ध क्लेडलाई यसका सदस्यहरूद्वारा इन्कोड गरिएका BGC हरूको अधिकतम सङ्ख्या गणना गरेर मात्र होइन, यी BGC हरूको विविधताको मूल्याङ्कन गरेर पनि चित्रण गर्‍यौं, जसले विभिन्न प्रकारका प्राकृतिक उम्मेद्वार उत्पादनहरू (चित्र 2c र विधिहरू) को आवृत्ति बताउँछ। )।।हामीले यो अध्ययनमा विशेष रूपमा इन्जिनियर गरिएको ब्याक्टेरिया MAGs द्वारा सबैभन्दा जैव-सिंथेटिक विविधता प्रजातिहरू प्रतिनिधित्व गरेको फेला पारेको छ।यी ब्याक्टेरियाहरू खेती नगरिएको फिलम Candidatus Eremiobacterota सँग सम्बन्धित छन्, जुन केही जीनोमिक अध्ययनहरू बाहेक धेरै हदसम्म अनपेक्षित रहन्छ।यो उल्लेखनीय छ कि "ca।Eremiobacterota जीनसलाई स्थलीय वातावरणमा मात्र विश्लेषण गरिएको छ र BGC मा समृद्ध कुनै सदस्यहरू समावेश गर्न ज्ञात छैन।यहाँ हामीले एउटै प्रजातिका आठ एमएजीहरू (न्यूक्लियोटाइड पहिचान > 99%) पुन: निर्माण गरेका छौं 23. त्यसैले हामीले प्रजातिको नाम "क्यान्डीडेटस युडोरेमिक्रोबियम मालास्पिनी" प्रस्ताव गर्छौं, ग्रीक पौराणिक कथा र अभियानहरूमा एक सुन्दर उपहार, नेरिड (समुद्री निम्फ) को नाममा राखिएको छ।'का.फाइलोजेनेटिक एनोटेसन 13 अनुसार, E. malaspinii को अनुक्रम स्तर भन्दा तल कुनै पहिले ज्ञात नातेदारहरू छैनन् र यसैले हामीले प्रस्ताव गरेको नयाँ ब्याक्टेरिया परिवारसँग सम्बन्धित छ "Ca।E. malaspinii" प्रकारको प्रजाति र "Ca।Eudormicrobiaceae" आधिकारिक नामको रूपमा (पूरक जानकारी)।'Ca का संक्षिप्त मेटाजेनोमिक पुनर्निर्माण।E. malaspinii जीनोम परियोजना धेरै कम इनपुट, लामो पढिएको मेटाजेनोमिक अनुक्रम र एकल नमूना (विधिहरू) को एकल 9.63 Mb रैखिक क्रोमोजोमको रूपमा 75 kb डुप्लिकेशनको रूपमा लक्षित एसेम्बली द्वारा मान्य गरिएको थियो।एकमात्र बाँकी रहेको अस्पष्टताको रूपमा।
यस प्रजातिको फाइलोजेनेटिक सन्दर्भ स्थापित गर्न, हामीले लक्षित जीनोम पुनर्निर्माण मार्फत तारा महासागर अभियानबाट अतिरिक्त युकेरियोटिक-समृद्ध मेटाजेनोमिक नमूनाहरूमा 40 नजिकका सम्बन्धित प्रजातिहरू खोज्यौं।छोटकरीमा, हामीले "Ca" सँग सम्बन्धित जीनोमिक टुक्राहरूसँग मेटाजेनोमिक रिडहरू लिङ्क गरेका छौं।E. malaspinii" र परिकल्पना गरिएको छ कि यस नमूनामा बढेको भर्ती दरले अन्य नातेदारहरू (विधिहरू) को उपस्थितिलाई संकेत गर्दछ।नतिजा स्वरूप, हामीले नयाँ परिभाषित परिवार (जस्तै "Ca. Eudormicrobiaceae") भित्र तीन जेनेरामा पाँच प्रजातिहरू प्रतिनिधित्व गर्ने 19 MAGs को संयोजन, 10 MAGs फेला पार्यौं।म्यानुअल निरीक्षण र गुणस्तर नियन्त्रण (विस्तारित डाटा, चित्र 6 र थप जानकारी) पछि, हामीले फेला पार्यौं कि "Ca.Eudormicrobiaceae प्रजातिहरूले अन्य "Ca" सदस्यहरूको तुलनामा ठूला जीनोमहरू (8 Mb) र समृद्ध बायोसिन्थेटिक क्षमता (प्रति प्रजाति 14 देखि 22 BGC) प्रस्तुत गर्दछ।Clade Eremiobacterota (7 BGC सम्म) (चित्र 3a–c)।
a, पाँच 'Ca को फाइलोजेनेटिक स्थिति।Eudormicrobiaceae को प्रजातिहरूले यस अध्ययनमा पहिचान गरिएको समुद्री रेखाहरूमा विशिष्ट BGC समृद्धि देखाए।फाइलोजेनेटिक रूखले सबै 'Ca' समावेश गर्दछ।MAG Eremiobacterota र GTDB (संस्करण 89) मा उपलब्ध गराइएका अन्य फिला (कोष्ठकमा जीनोम नम्बरहरू) को सदस्यहरू विकासवादी पृष्ठभूमि (विधिहरू) को लागि प्रयोग गरियो।बाहिरी तहहरूले पारिवारिक स्तर ("Ca. Eudormicrobiaceae" र "Ca. Xenobiaceae") र वर्ग स्तर ("Ca. Eremiobacteria") मा वर्गीकरण प्रतिनिधित्व गर्दछ।यस अध्ययनमा वर्णन गरिएका पाँच प्रजातिहरूलाई अल्फान्यूमेरिक कोडहरू र प्रस्तावित द्विपद नामहरू (पूरक जानकारी) द्वारा प्रतिनिधित्व गरिएको छ।ख, ठीक छ।Eudormicrobiaceae प्रजातिहरूले सात साझा BGC केन्द्रकहरू साझा गर्छन्।A2 क्लेडमा BGC को अनुपस्थिति प्रतिनिधि MAG (पूरक तालिका 3) को अपूर्णताको कारण थियो।BGC हरू "Ca।एम्फिथोमाइक्रोबियम" र "सीए।एम्फिथोमाइक्रोबियम" (क्लेड ए र बी) देखाइएको छैन।c, सबै BGC हरू "Ca।Eudoremicrobium taraoceanii तारा को महासागरहरु बाट लिइएको 623 metatransscriptomes मा व्यक्त गरिएको पाइयो।ठोस सर्कलहरूले सक्रिय ट्रान्सक्रिप्शनलाई संकेत गर्दछ।सुन्तला सर्कलहरूले गृहकार्य जीन अभिव्यक्ति दर (विधिहरू) को तल र माथि लग २-रूपान्तरित तह परिवर्तनहरूलाई जनाउँछ।d, सापेक्ष प्रचुरता वक्र (विधि) देखाउँदै 'Ca।Eudormicrobiaceae को प्रजातिहरू प्रायः समुद्री बेसिनहरूमा र सम्पूर्ण पानीको स्तम्भमा (सतहदेखि कम्तीमा 4000 मिटरको गहिराइमा) व्यापक छन्।यी अनुमानहरूको आधारमा, हामीले फेला पारेका छौं कि 'Ca.E. malaspinii' ले गहिरो-समुद्री पेलाजिक ग्रेन-सम्बन्धित समुदायहरूमा प्रोकारियोटिक कोशिकाहरूको 6% सम्मको लागि योगदान गर्दछ।हामीले कुनै प्रजातिलाई साइटमा उपस्थित भएको मानेका थियौं यदि यो दिइएको गहिराइ तहको आकारको कुनै अंशमा फेला पर्यो।IO - हिन्द महासागर, NAO - उत्तर अटलांटिक, NPO - उत्तर प्रशान्त, RS - लाल सागर, SAO - दक्षिण अटलांटिक, SO - दक्षिणी महासागर, SPO - दक्षिण प्रशान्त।
Ca को प्रशस्तता र वितरण अध्ययन गर्दै।Eudormicrobiaceae, जसलाई हामीले फेला पार्‍यौं, धेरैजसो समुद्री बेसिनहरूमा, साथै सम्पूर्ण पानीको स्तम्भमा प्रबल हुन्छ (चित्र 3d)।स्थानीय रूपमा, तिनीहरू समुद्री माइक्रोबियल समुदायको 6% बनाउँछन्, तिनीहरूलाई विश्वव्यापी समुद्री माइक्रोबायोमको महत्त्वपूर्ण भाग बनाउँदछ।थप रूपमा, हामीले Ca को सापेक्ष सामग्री भेट्टायौं।Eudormicrobiaceae प्रजातिहरू र तिनीहरूको BGC अभिव्यक्ति स्तरहरू युकेरियोटिक समृद्ध अंश (चित्र 3c र विस्तारित डेटा, चित्र 7) मा उच्चतम थियो, प्लैंकटन सहित कण पदार्थसँग सम्भावित अन्तरक्रियालाई संकेत गर्दछ।यो अवलोकनले 'Ca' सँग केही मिल्दोजुल्दो छ।Eudoremicrobium BGCs जसले ज्ञात मार्गहरू मार्फत साइटोटोक्सिक प्राकृतिक उत्पादनहरू उत्पादन गर्दछ, सिकारी व्यवहार (पूरक जानकारी र विस्तारित डाटा, चित्र 8) प्रदर्शन गर्न सक्छ, अन्य शिकारीहरू जस्तै जसले विशेष रूपमा Myxococcus41 जस्ता मेटाबोलाइटहरू उत्पादन गर्दछ।Ca को खोज।Eudormicrobiaceae कम उपलब्ध (गहिरो महासागर) वा प्रोकारियोटिक नमूनाहरूको सट्टा युकेरियोटिकले यी ब्याक्टेरिया र तिनीहरूको अप्रत्याशित BGC विविधता प्राकृतिक खाद्य अनुसन्धानको सन्दर्भमा अस्पष्ट किन रहन्छ भनेर व्याख्या गर्न सक्छ।
अन्ततः, हामीले नयाँ मार्गहरू, इन्जाइमहरू, र प्राकृतिक उत्पादनहरू पत्ता लगाउनमा हाम्रो माइक्रोबायोम-आधारित कार्यको प्रतिज्ञालाई प्रयोगात्मक रूपमा प्रमाणित गर्न खोज्यौं।BGCs को विभिन्न वर्गहरू मध्ये, RiPP मार्ग परिपक्व इन्जाइमहरू द्वारा कोर पेप्टाइडको विभिन्न पोस्ट-अनुवादात्मक परिमार्जनहरूको कारणले समृद्ध रासायनिक र कार्यात्मक विविधतालाई एन्कोड गर्न जानिन्छ।त्यसैले हामीले दुई 'सीए' रोज्यौं।Eudoremicrobium' RiPP BGCs (चित्र 3b र 4a-e) कुनै पनि ज्ञात BGC (\(\bar{d}\)MIBiG र \(\bar{d}\) ०.२ माथिको RefSeq मा आधारित छन्।
a–c, इन भिट्रो हेटेरोलोगस अभिव्यक्ति र उपन्यास (\(\bar{d}\)RefSeq = 0.29) गहिरो समुद्री Ca प्रजातिहरूको लागि विशिष्ट RiPP बायोसिंथेसिसको क्लस्टरको इन भिट्रो एन्जाइमेटिक एसेज।E. malaspinii' ले डाइफोस्फोरिलेटेड उत्पादनहरूको उत्पादन गर्न नेतृत्व गर्यो।c, उच्च-रिजोल्युसन (HR) MS/MS (रासायनिक संरचनामा b र y आयनहरू द्वारा संकेत गरिएको खण्डीकरण) र NMR (विस्तारित डेटा, चित्र 9) प्रयोग गरेर पहिचान गरिएका परिमार्जनहरू।d, यो फास्फोरिलेटेड पेप्टाइडले स्तनधारी न्यूट्रोफिल इलास्टेजको कम माइक्रोमोलर अवरोध प्रदर्शन गर्दछ, जुन नियन्त्रण पेप्टाइड र निर्जलीकरण पेप्टाइड (रासायनिक हटाउने प्रेरित निर्जलीकरण) मा पाइँदैन।प्रयोग समान परिणाम संग तीन पटक दोहोर्याइएको थियो।उदाहरणका लागि, दोस्रो उपन्यास \(\bar{d}\)RefSeq = 0.33) प्रोटीन बायोसिन्थेसिसको क्लस्टरको हेटेरोलोगस अभिव्यक्तिले 46 एमिनो एसिड कोर पेप्टाइडलाई परिमार्जन गर्ने चार परिपक्व इन्जाइमहरूको कार्यलाई स्पष्ट गर्दछ।अवशेषहरू HR-MS/MS, आइसोटोप लेबलिङ, र NMR विश्लेषण (पूरक जानकारी) द्वारा भविष्यवाणी गरिएको परिमार्जनको साइट अनुसार दाग छन्।ड्यास गरिएको रंगले संकेत गर्दछ कि परिमार्जन दुई अवशेषहरू मध्ये कुनैमा हुन्छ।चित्र एउटै न्यूक्लियसमा सबै परिपक्व इन्जाइमहरूको गतिविधि देखाउन असंख्य हेटरोलगस निर्माणहरूको संकलन हो।h, ब्याकबोन एमाइड एन-मेथिलेसनको लागि NMR डेटाको चित्रण।पूर्ण परिणामहरू चित्रमा देखाइएको छ।10 विस्तारित डाटा संग।i, MIBiG 2.0 डाटाबेसमा पाइने सबै FkbM डोमेनहरू बीच परिपक्व FkbM प्रोटीन क्लस्टर इन्जाइमको Phylogenetic स्थितिले N-methyltransferase गतिविधि (पूरक जानकारी) भएको यो परिवारको इन्जाइमलाई प्रकट गर्दछ।BGCs (a, e), अग्रसर पेप्टाइड संरचना (b, f), र प्राकृतिक उत्पादनहरू (c, g) को पुटेटिभ रासायनिक संरचनाहरूको योजनाबद्ध रेखाचित्रहरू देखाइएका छन्।
पहिलो RiPP मार्ग (\(\bar{d}\)MIBiG = 0.41, \(\bar{d}\)RefSeq = 0.29) गहिरो-समुद्री प्रजातिहरूमा मात्र फेला परेको थियो "Ca।E. malaspinii" र पेप्टाइड- precursor को लागी कोड (चित्र 4a, b)।यस परिपक्व इन्जाइममा, हामीले ल्यान्टीपेप्टाइड सिन्थेजको निर्जलीकरण डोमेनमा एकल कार्यात्मक डोमेन होमोलोगस पहिचान गरेका छौं जसले सामान्यतया फोस्फोराइलेशन र 43 (पूरक जानकारी) को पछि हटाउने उत्प्रेरित गर्दछ।त्यसकारण, हामी भविष्यवाणी गर्छौं कि अग्रसर पेप्टाइडको परिमार्जनमा यस्तो दुई-चरण निर्जलीकरण समावेश छ।यद्यपि, टेन्डम मास स्पेक्ट्रोमेट्री (MS/MS) र आणविक चुम्बकीय अनुनाद स्पेक्ट्रोस्कोपी (NMR) को प्रयोग गरेर, हामीले एक पोलिफोस्फोरिलेट रैखिक पेप्टाइड (चित्र 4c) पहिचान गर्यौं।यद्यपि अप्रत्याशित रूपमा, हामीले यसको अन्तिम उत्पादनको समर्थन गर्न प्रमाणका धेरै रेखाहरू फेला पार्यौं: दुई फरक हेट्रोलोगस होस्टहरू र इन भिट्रो एसेसहरूमा कुनै निर्जलीकरण छैन, परिपक्व इन्जाइमको उत्प्रेरक निर्जलीकरण साइटमा उत्परिवर्तित मुख्य अवशेषहरूको पहिचान।सबै "Ca" द्वारा पुनर्निर्माण।E. malaspinii जीनोम (विस्तारित डाटा, चित्र 9 र थप जानकारी) र अन्तमा, फस्फोरिलेटेड उत्पादनको जैविक गतिविधि, तर रासायनिक रूपमा संश्लेषित निर्जलित फारम (चित्र 4d) होइन।वास्तवमा, हामीले फेला पार्‍यौं कि यसले न्यूट्रोफिल इलास्टेज विरुद्ध कम माइक्रोमोलर प्रोटीज अवरोध गतिविधि प्रदर्शन गर्दछ, एकाग्रता दायरा (IC50 = 14.3 μM) 44 मा अन्य सम्बन्धित प्राकृतिक उत्पादनहरूसँग तुलना गर्न सकिन्छ, यस तथ्यको बावजुद पारिस्थितिक भूमिका स्पष्ट हुन बाँकी छ।यी परिणामहरूको आधारमा, हामी मार्गलाई "फस्फेप्टिन" नाम दिने प्रस्ताव गर्छौं।
दोस्रो केस एक जटिल RiPP मार्ग हो 'Ca को लागि विशिष्ट।जीनस Eudoremicrobium (\(\bar{d}\)MIBiG = 0.46, \(\bar{d}\)RefSeq = 0.33) लाई प्राकृतिक प्रोटीन उत्पादनहरू (चित्र 4e) इन्कोड गर्ने भविष्यवाणी गरिएको थियो।अपेक्षाकृत छोटो BGCs45 द्वारा इन्कोड गरिएका इन्जाइमहरूद्वारा स्थापित अपेक्षित घनत्व र असामान्य रासायनिक परिमार्जनहरूको विविधताका कारण यी मार्गहरू विशेष बायोटेक्नोलोजिकल रुचिका हुन्।हामीले पत्ता लगायौं कि यो प्रोटिन पहिलेको विशेषतायुक्त प्रोटिनहरू भन्दा फरक छ किनकि यसमा पोलिसेरामाइड्सको मुख्य NX5N मोटिफ र ल्यान्डोरनामाइड्स 46 को ल्यान्थियोनाइन लुप दुवैको अभाव छ।सामान्य हेटेरोलोगस अभिव्यक्ति ढाँचाहरूको सीमितताहरू पार गर्न, हामीले तिनीहरूलाई चार परिपक्व मार्ग इन्जाइमहरू (विधिहरू) विशेषता गर्न अनुकूलन माइक्रोभरगुला एरोडेनिट्रिफिकन्स प्रणालीको साथ प्रयोग गर्यौं।MS/MS, आइसोटोप लेबलिङ, र NMR को संयोजन प्रयोग गरेर, हामीले पेप्टाइडको 46-एमिनो एसिड कोरमा यी परिपक्व इन्जाइमहरू पत्ता लगायौं (चित्र 4f,g, विस्तारित डेटा, फिग। 10-12 र थप जानकारी)।परिपक्व इन्जाइमहरू मध्ये, हामीले RiPP मार्गमा FkbM O-methyltransferase परिवारको सदस्य 47 को पहिलो उपस्थितिको विशेषता राख्यौं र अप्रत्याशित रूपमा फेला पर्यो कि यो परिपक्व इन्जाइमले ब्याकबोन एन-मेथिलेसन (चित्र 4h, i र थप जानकारी) परिचय गराउँछ।यद्यपि यो परिमार्जन प्राकृतिक NRP48 उत्पादनहरूमा ज्ञात छ, एमाइड बन्डहरूको इन्जाइम्याटिक एन-मेथिलेसन एक जटिल तर जैव-प्रविधिको रूपमा महत्त्वपूर्ण प्रतिक्रिया हो जुन अहिलेसम्म बोरोसिनहरूको RiPP परिवारको लागि चासोको विषय भएको छ।विशिष्टता ५०,५१।एन्जाइमहरू र RiPP को अन्य परिवारहरूमा यस गतिविधिको पहिचानले नयाँ अनुप्रयोगहरू खोल्न र प्रोटीन 52 र तिनीहरूको रासायनिक विविधताको कार्यात्मक विविधता विस्तार गर्न सक्छ।पहिचान गरिएका परिमार्जनहरू र प्रस्तावित उत्पादन संरचनाको असामान्य लम्बाइको आधारमा, हामी मार्गको नाम "पाइथोनामाइड" प्रस्ताव गर्छौं।
इन्जाइमहरूको कार्यात्मक विशेषता परिवारमा अप्रत्याशित इन्जाइमोलजीको खोजले नयाँ आविष्कारहरूको लागि वातावरणीय जीनोमिक्सको प्रतिज्ञालाई चित्रण गर्दछ, र केवल अनुक्रम होमलोजीमा आधारित कार्यात्मक अनुमानको लागि सीमित क्षमतालाई पनि चित्रण गर्दछ।यसरी, गैर-क्यानोनिकल बायोएक्टिभ पोलिफोस्फोरिलेटेड RiPPs को रिपोर्टहरूको साथमा, हाम्रा परिणामहरूले जैव रासायनिक यौगिकहरूको कार्यात्मक समृद्धि, विविधता, र असामान्य संरचनाहरूलाई पूर्ण रूपमा उजागर गर्न सिंथेटिक जीवविज्ञान प्रयासहरूको लागि संसाधन-गहन तर महत्वपूर्ण मूल्य प्रदर्शन गर्दछ।
यहाँ हामी वैज्ञानिक समुदाय (https://microbiomics.io/ocean/) को परिणाम स्रोत उपलब्ध गराएर भविष्यको अनुसन्धानलाई सहज बनाउँदै, विश्वव्यापी समुद्री माइक्रोबायोममा सूक्ष्म जीवहरू र तिनीहरूको जीनोमिक सन्दर्भद्वारा इन्कोड गरिएको बायोसिंथेटिक क्षमताको दायरा प्रदर्शन गर्छौं।हामीले पत्ता लगायौं कि यसको धेरै फाइलोजेनेटिक र कार्यात्मक नवीनता MAGs र SAGs को पुन: निर्माण गरेर मात्र प्राप्त गर्न सकिन्छ, विशेष गरी कम प्रयोग गरिएका माइक्रोबियल समुदायहरूमा जसले भविष्यको बायोप्रोस्पेक्टिङ प्रयासहरूलाई मार्गदर्शन गर्न सक्छ।यद्यपि हामी यहाँ 'Ca' मा केन्द्रित हुनेछौं।Eudormicrobiaceae” वंशको रूपमा विशेष गरी जैव-सिंथेटिक रूपमा “प्रतिभाशाली”, पत्ता नलागेको माइक्रोबायोटामा भविष्यवाणी गरिएका धेरै BGCs ले वातावरणीय र/वा बायोटेक्नोलोजिकल रूपमा महत्त्वपूर्ण कार्यहरूका साथ यौगिकहरू उत्पादन गर्ने पहिल्यै वर्णन नगरिएका इन्जाइमोलजीहरू इन्कोड गर्न सक्छन्।
समुन्द्री बेसिनहरू, गहिरो तहहरूमा र समयसँगै विश्वव्यापी समुद्री माइक्रोबियल समुदायहरूको कभरेजलाई अधिकतम बनाउन पर्याप्त अनुक्रम गहिराइको साथ प्रमुख समुद्री विज्ञान र समय श्रृंखला अध्ययनहरूबाट मेटाजेनोमिक डेटासेटहरू समावेश गरिएको थियो।यी डेटासेटहरू (पूरक तालिका 1 र चित्र 1) ताराको महासागरहरूमा सङ्कलन गरिएका नमूनाहरूबाट मेटाजेनोमिक्स समावेश छन् (भाइरल समृद्ध, n=190; प्रोकारियोटिक समृद्ध, n=180) 12,22 र BioGEOTRACES अभियान (n=480)।Hawaiian Oceanic Time Series (HOT, n = 68), Bermuda-Atlantic Time Series (BATS, n = 62)21 र Malaspina Expedition (n = 58)23।सबै मेटाजेनोमिक टुक्राहरूबाट सिक्वेन्सिङ रिडहरू BBMap (v.38.71) को प्रयोग गरेर रिडहरूबाट सिक्वेन्सिङ एडेप्टरहरू हटाएर, क्वालिटी कन्ट्रोल सिक्वेन्स (PhiX genomes) मा म्याप गरिएका रिडहरू हटाएर र trimq=14, maq=20 प्रयोग गरेर गुणस्तरको लागि फिल्टर गरिएको थियो। maxns = 0 र minlength = 45। त्यसपछिका विश्लेषणहरू चलाइयो वा QC पठनहरूसँग मर्ज गरियो यदि निर्दिष्ट गरियो (bbmerge.sh minoverlap=16)।QC रिडिङहरू सामान्यीकृत गरियो (bbnorm.sh लक्ष्य = 40, माइन्डडेप्थ = 0) मेटास्पेडहरू प्रयोग गरेर निर्माण गर्नु अघि (v.3.11.1 वा v.3.12 यदि आवश्यक भएमा)53।परिणामस्वरूप स्क्याफोल्ड कन्टिगहरू (यसपछि स्क्याफोल्डहरू भनिन्छ) अन्ततः लम्बाइ (≥1 kb) द्वारा फिल्टर गरिएको थियो।
1038 मेटाजेनोमिक नमूनाहरूलाई समूहहरूमा विभाजन गरिएको थियो, र नमूनाहरूको प्रत्येक समूहको लागि, सबै नमूनाहरूको मेटाजेनोमिक गुणस्तर नियन्त्रण पढाइहरू प्रत्येक नमूनाको कोष्ठकहरूसँग अलग-अलग मिलाइयो, परिणामस्वरूप निम्न संख्यामा जोडी रूपमा कोष्ठक गरिएको समूह पढियो: तारा समुद्री भाइरस - समृद्ध (190×190), Prokaryotes Enriched (180×180), BiogeoTRACES, HOT and BATS (610×610) र Malaspina (58×58)।म्यापिङ Burrows-Wheeler-Aligner (BWA) (v.0.7.17-r1188) 54 प्रयोग गरी गरिएको थियो जसले पठनहरूलाई माध्यमिक साइटहरूमा (-a फ्ल्याग प्रयोग गरेर) मिलाउन अनुमति दिन्छ।पङ्क्तिबद्धता कम्तिमा 45 आधार लामो हुन फिल्टर गरिएको थियो, ≥97% पहिचान छ, र स्प्यान ≥80% पढ्ने।परिणामस्वरूप BAM फाइलहरू प्रत्येक समूहको लागि अन्तर्- र अन्तर-नमूना कभरेज प्रदान गर्न MetaBAT2 (v.2.12.1) 55 को लागि jgi_summarize_bam_contig_depths स्क्रिप्ट प्रयोग गरी प्रशोधन गरिएको थियो।अन्तमा, -minContig 2000 र -maxEdges 500 सँग सबै नमूनाहरूमा व्यक्तिगत रूपमा MetaBAT2 चलाएर संवेदनशीलता बढाउन कोष्ठकहरूलाई समूहबद्ध गरिएको थियो। हामीले ensemble बक्सरको सट्टा MetaBAT2 प्रयोग गर्छौं किनभने यसलाई स्वतन्त्र परीक्षणहरूमा सबैभन्दा प्रभावकारी एकल बक्सरको रूपमा देखाइएको छ।र अन्य सामान्य रूपमा प्रयोग हुने बक्सरहरू भन्दा १० देखि ५० गुणा छिटो ५७।प्रचुरता सहसम्बन्धको प्रभावको लागि परीक्षण गर्न, मेटाजेनोमिक्सको अनियमित रूपमा चयन गरिएको उपनमूना (दुई तारा महासागर डाटासेटहरू मध्ये प्रत्येकको लागि 10, BioGEOTRACES को लागि 10, प्रत्येक समय श्रृंखलाको लागि 5, र मालास्पिनाका लागि 5) थप नमूनाहरू मात्र प्रयोग गरियो।आन्तरिक नमूनाहरू कभरेज जानकारी प्राप्त गर्न समूहबद्ध छन्।(थप जानकारी)।
पछिको विश्लेषणमा थप (बाह्य) जीनोमहरू समावेश गरिएका थिए, तारा महासागर २६ डाटासेटको सबसेटबाट म्यानुअल रूपमा चयन गरिएका ८३० MAGs, GORG20 डाटासेटबाट ५२८७ SAGs, र MAR डाटाबेस (MarDB v. 4) बाट 1707 REFsol र डाटासेट गरिएको छ। 682 SAGs) 27. MarDB डेटासेटको लागि, नमूना प्रकार निम्न नियमित अभिव्यक्तिसँग मेल खान्छ भने उपलब्ध मेटाडेटाको आधारमा जीनोमहरू चयन गरिन्छ: '[S|s]ingle.?[C|c]ell|[C|c]ulture| [I|i] पृथक'।
प्रत्येक मेटाजेनोमिक कन्टेनर र बाह्य जीनोमहरूको गुणस्तर CheckM (v.1.0.13) र Anvi'o's Lineage Workflow (v.5.5.0) 58,59 प्रयोग गरी मूल्याङ्कन गरिएको थियो।यदि CheckM वा Anvi'o ले ≥50% पूर्णता/पूर्णता र ≤10% दूषितता/रिडन्डन्सी रिपोर्ट गर्छ, त्यसपछि मेटाजेनोमिक सेलहरू र बाह्य जीनोमहरू पछि विश्लेषणको लागि बचत गर्नुहोस्।यी स्कोरहरूलाई निम्नानुसार सामुदायिक मापदण्ड 60 अनुसार जीनोम गुणस्तर वर्गीकरण गर्न मतलब पूर्णता (mcpl) र मतलब प्रदूषण (mctn) मा मिलाइएको थियो: उच्च गुणस्तर: mcpl ≥ 90% र mctn ≤ 5%;राम्रो गुणस्तर: mcpl ≥ 70%, mctn ≤ 10%, मध्यम गुणस्तर: mcpl ≥ 50% र mctn ≤ 10%, उचित गुणस्तर: mcpl ≤ 90% वा mctn ≥ 10%।फिल्टर गरिएको जीनोमहरू निम्नानुसार गुणस्तर स्कोर (Q र Q') सँग सम्बन्धित थिए: Q = mcpl – 5 x mctn Q' = mcpl – 5 x mctn + mctn x (स्ट्रेन परिवर्तनशीलता)/100 + 0.5 x लग[N50]।(dRep61 मा लागू गरिएको)।
विभिन्न डेटा स्रोतहरू र जीनोम प्रकारहरू (MAG, SAG र REF) बीच तुलनात्मक विश्लेषणलाई अनुमति दिन, 34,799 जीनोमहरू dRep (v.2.5.4) को प्रयोग गरेर जीनोम-वाइड औसत न्यूक्लियोटाइड पहिचान (ANI) मा आधारित रहे।दोहोरिन्छ)61 95% ANI थ्रेसहोल्डहरू 28,62 (-comp 0 -con 1000 -sa 0.95 -nc 0.2) र एकल-प्रतिलिपि मार्कर जीनहरू SpecI63 प्रयोग गरी प्रजाति स्तरमा जीनोम क्लस्टरिङ प्रदान गर्दछ।माथि परिभाषित अधिकतम गुणस्तर स्कोर (Q') अनुसार प्रत्येक dRep क्लस्टरको लागि प्रतिनिधि जीनोम चयन गरिएको थियो, जुन प्रजातिहरूको प्रतिनिधि मानिन्थ्यो।
म्यापिङ गति मूल्याङ्कन गर्न, BWA (v.0.7.17-r1188, -a) OMD मा समावेश 34,799 जीनोमहरू सहित सबै 1038 सेट मेटाजेनोमिक रिडहरू नक्सा गर्न प्रयोग गरिएको थियो।गुणस्तर-नियन्त्रित पढाइहरू एकल-अन्त मोडमा म्याप गरिएको थियो र नतिजा पङ्क्तिबद्धताहरू मात्र पङ्क्तिबद्धता ≥45 bp लम्बाइमा राख्न फिल्टर गरिएको थियो।र पहिचान ≥95%।प्रत्येक नमूनाको लागि प्रदर्शन अनुपात फिल्टरेशन पछि बाँकी पढाइको प्रतिशतलाई गुणस्तर नियन्त्रण पढाइहरूको कुल संख्याले विभाजित गर्दछ।उही दृष्टिकोण प्रयोग गर्दै, प्रत्येक 1038 मेटाजेनोमहरू 5 मिलियन सम्मिलितहरू (विस्तारित डाटा, चित्र 1c) मा घटाइयो र OMD र सबै GEM16 मा GORG SAG सँग मेल खायो।GEM16 क्याटलगमा समुद्री पानीबाट बरामद MAGs को मात्रा मेटाजेनोमिक स्रोतहरूको खोजशब्द प्रश्नहरूद्वारा निर्धारण गरिएको थियो, समुद्री पानीका नमूनाहरू चयन गरेर (जस्तै, समुद्री तलछटहरूको विपरीत)।विशेष रूपमा, हामी "जलीय" लाई "इकोसिस्टम_श्रेणी", "सामुद्रिक" "इकोसिस्टम_प्रकार" को रूपमा चयन गर्छौं, र "गहिरो महासागर", "सामुद्रिक", "सामुद्रिक महासागर", "पेलाजिक समुद्री", "सामुद्रिक पानी" को रूपमा फिल्टर गर्छौं। "महासागर", "समुद्री पानी", "सतह सागरको पानी", "सतह सागरको पानी"।यसको परिणामस्वरूप 5903 MAGs (734 उच्च गुणस्तर) 1823 OTUs मा वितरित भयो (यहाँ हेराइहरू)।
प्रोकारियोटिक जीनोमहरू GTDB-Tk (v.1.0.2)64 को GTDB r89 संस्करण 13 लाई लक्षित गर्ने पूर्वनिर्धारित प्यारामिटरहरू प्रयोग गरेर वर्गीकरण रूपमा एनोटेट गरिएको थियो। Anvi'o डोमेन भविष्यवाणीमा आधारित युकेरियोटिक जीनोमहरू पहिचान गर्न र ≥50% र रिडन्डन्सी%10 रिकल गर्न प्रयोग गरिएको थियो।एक प्रजातिको वर्गीकरण एनोटेसन यसको प्रतिनिधि जीनोम मध्ये एक को रूप मा परिभाषित गरिएको छ।eukaryotes (148 MAG) को अपवाद बाहेक, प्रत्येक जीनोम पहिलो पटक प्रोक्का (v.1.14.5)65 को प्रयोग गरी कार्यात्मक रूपमा एनोटेट गरिएको थियो, पूर्ण जीनहरू नामकरण गर्दै, "आर्किया" वा "ब्याक्टेरिया" मापदण्डहरूलाई आवश्यक रूपमा परिभाषित गर्दै, जुन गैर-का लागि पनि रिपोर्ट गरिएको छ। कोडिङ जीन।र CRISPR क्षेत्रहरू, अन्य जीनोमिक विशेषताहरू बीच।fetchMG (v.1.2)66 को प्रयोग गरेर विश्वव्यापी एकल-प्रतिलिपि मार्कर जीनहरू (uscMG) पहिचान गरेर भविष्यवाणी गरिएका जीनहरू एनोटेट गर्नुहोस्, एग्नोग (v.5.0)68 मा आधारित एम्पपर (v.2.0.1) 67 प्रयोग गरेर अर्थोलग समूहहरू र क्वेरी तोक्नुहोस्।KEGG डाटाबेस (फेब्रुअरी 10, 2020 मा प्रकाशित) 69. अन्तिम चरण DIAMOND (v.0.9.30) 70 ≥70% को क्वेरी र विषय कभरेज प्रयोग गरी KEGG डाटाबेसमा प्रोटिनहरू मिलाएर प्रदर्शन गरिएको थियो।NCBI प्रोकारियोटिक जीनोम एनोटेसन पाइपलाइन 71 अनुसार अधिकतम अपेक्षित बिटरेटको ≥ 50% (लिङ्क आफैं) को आधारमा परिणामहरू थप फिल्टर गरियो।पूर्वनिर्धारित प्यारामिटरहरू र विभिन्न क्लस्टर विस्फोटहरू सहित antiSMASH (v.5.1.0)72 को प्रयोग गरेर जीनोममा BGCs पहिचान गर्नका लागि जीन अनुक्रमहरू पनि इनपुटको रूपमा प्रयोग गरियो।सबै जीनोमहरू र एनोटेसनहरू वेबमा उपलब्ध प्रासंगिक मेटाडेटाको साथ OMD मा कम्पाइल गरिएको छ (https://microbiomics.io/ocean/)।
पहिले वर्णन गरिएका विधिहरू जस्तै १२,२२ हामीले CD-HIT (v.4.8.1) लाई क्लस्टर गर्न प्रयोग गर्यौं > OMD बाट ब्याक्टेरिया र पुरातात्विक जीनोमहरूबाट 95% पहिचान र छोटो जीनहरू (90% कभरेज) 73 सम्म। >17.7 मिलियन जीन क्लस्टरहरू।सबैभन्दा लामो अनुक्रम प्रत्येक जीन क्लस्टरको लागि प्रतिनिधि जीनको रूपमा चयन गरिएको थियो।1038 मेटाजेनोमहरू त्यसपछि> 17.7 मिलियन BWA (-a) क्लस्टर सदस्यहरूसँग मिलाइयो र परिणामस्वरूप BAM फाइलहरू ≥95% प्रतिशत पहिचान र ≥45 आधार पङ्क्तिबद्धताहरूसँग मात्र पङ्क्तिबद्धताहरू राख्न फिल्टर गरियो।लम्बाइ-सामान्यीकृत जीन प्रचुरतालाई उत्कृष्ट अद्वितीय पङ्क्तिबद्धताबाट पहिलो गणना इन्सर्टहरू द्वारा गणना गरिएको थियो र त्यसपछि, फजी-म्याप गरिएको सम्मिलितहरूका लागि, तिनीहरूको अद्वितीय सम्मिलितहरूको संख्यासँग समानुपातिक लक्ष्य जीनहरूमा आंशिक गणनाहरू थपेर।
विस्तारित MOTU सन्दर्भ डाटाबेस सिर्जना गर्न विस्तारित OMD (“Ca. Eudormicrobiaceae” बाट थप MAGs सहित, तल हेर्नुहोस्) को जीनोमहरू mOTUs74 मेटाजेनोमिक विश्लेषण उपकरण डाटाबेस (v.2.5.1) मा थपियो।दस यूएससीएमजीहरूमध्ये केवल छवटा एकल-प्रतिलिपि जीनोमहरू (२३,५२८ जीनोमहरू) बाँचे।डाटाबेसको विस्तारले प्रजाति स्तरमा 4,494 थप क्लस्टरहरूको परिणामस्वरूप।1038 मेटाजेनोमहरू पूर्वनिर्धारित MOTU प्यारामिटरहरू (v.2) प्रयोग गरेर विश्लेषण गरियो।644 एमओटीयू क्लस्टरहरू (95% REF, 5% SAG र 99.9% MarDB सँग सम्बन्धित) मा रहेको कुल 989 जीनोमहरू एमओटीयू प्रोफाइलले पत्ता लगाएनन्।यसले MarDB जीनोमहरूको समुद्री अलगावका विभिन्न अतिरिक्त स्रोतहरू प्रतिबिम्बित गर्दछ (धेरै जसो पत्ता नलागेका जीनोमहरू तलछट, समुद्री होस्टहरू, आदिबाट अलग गरिएका जीवहरूसँग सम्बन्धित छन्)।यस अध्ययनमा खुला महासागर वातावरणमा ध्यान केन्द्रित गर्न जारी राख्न, हामीले तिनीहरूलाई डाउनस्ट्रीम विश्लेषणबाट बहिष्कृत गर्यौं जबसम्म तिनीहरू पत्ता लागेनन् वा यस अध्ययनमा सिर्जना गरिएको विस्तारित एमओटीयू डाटाबेसमा समावेश गरिएन।
OMD मा MAG, SAG र REF बाट सबै BGCs (माथि हेर्नुहोस्) सबै metagenomic scaffolds (antiSMASH v.5.0, पूर्वनिर्धारित प्यारामिटरहरू) मा पहिचान गरिएका BGCs सँग जोडिएको थियो र BiG-SLICE (v.1.1) (PFAM डोमेन )75 प्रयोग गरी विशेषता गरिएको थियो।यी सुविधाहरूको आधारमा, हामीले BGC हरू बीचको सबै कोसाइन दूरीहरू गणना गर्यौं र तिनीहरूलाई क्रमशः 0.2 र 0.8 को दूरी थ्रेसहोल्ड प्रयोग गरेर GCF र GCC मा समूहबद्ध गर्‍यौं।यी थ्रेसहोल्डहरू पहिले प्रयोग गरिएको थ्रेसहोल्डहरूको रूपान्तरण हो जसमा कोसाइन दूरीको साथमा Euclidean दूरी75 प्रयोग गरीएको थियो, जसले मूल BiG-SLICE क्लस्टरिङ रणनीति (पूरक जानकारी) मा भएका केही त्रुटिहरूलाई कम गर्छ।
BGCs लाई पहिले वर्णन गरिए अनुसार विखण्डनको जोखिम कम गर्न र 1038 मेटाजेनोमहरूमा फेला नपरेका MarDB REFs र SAGs बहिष्कार गर्नका लागि स्क्याफोल्डहरूमा एन्कोड गरिएको ≥5 kb मात्र राख्न फिल्टर गरिएको थियो (माथि हेर्नुहोस्)।यसले कुल 39,055 BGCs ओएमडी जीनोमद्वारा इन्कोड गरिएको थियो, थप 14,106 मेटाजेनोमिक टुक्राहरूमा पहिचान गरियो (अर्थात MAGs मा जोडिएको छैन)।यी "मेटाजेनोमिक" BGC हरू डाटाबेसमा कब्जा नगरिएको समुद्री माइक्रोबायोम बायोसिन्थेसिस क्षमताको अनुपात अनुमान गर्न प्रयोग गरिएको थियो (पूरक जानकारी)।प्रत्येक BGC कार्यात्मक रूपमा BiG-SCAPE76 मा परिभाषित एंटी-SMASH वा मोटे उत्पादन कोटिहरू द्वारा परिभाषित भविष्यवाणी उत्पादन प्रकारहरू अनुसार विशेषता थियो।परिमाणमा नमूना पूर्वाग्रहलाई रोक्नको लागि (GCC/GCF को वर्गीकरण र कार्यात्मक संरचना, GCF र GCC को सन्दर्भ डाटाबेसको दूरी, र GCF को मेटाजेनोमिक प्रचुरता), प्रत्येक प्रजातिको लागि GCF प्रति सबैभन्दा लामो BGC मात्र राखेर, 39,055 BGCs थप गरियो। कुल 17,689 BGC को परिणामस्वरूप।
GCC र GCF को नवीनता गणना गरिएको डाटाबेस (BIG-FAM मा RefSeq डाटाबेस) 29 र प्रयोगात्मक रूपमा प्रमाणित (MIBIG 2.0) 30 BGC बीचको दूरीको आधारमा मूल्याङ्कन गरिएको थियो।प्रत्येक 17,689 प्रतिनिधि BGC को लागि, हामीले सम्बन्धित डाटाबेसमा सबैभन्दा सानो कोसाइन दूरी रोज्यौं।यी न्यूनतम दूरीहरू उपयुक्त भए अनुसार GCF वा GCC अनुसार औसत (मतलब) गरिन्छ।डाटाबेसको दूरी ०.२ भन्दा बढी भएमा GCF लाई नयाँ मानिन्छ, जुन (औसत) GCF र सन्दर्भ बीचको एक आदर्श विभाजनसँग मेल खान्छ।GCC को लागि, हामी 0.4 छनोट गर्छौं, जुन GCF द्वारा परिभाषित थ्रेसहोल्डको दोब्बर हो, लिङ्कहरूसँग दीर्घकालीन सम्बन्धमा लक गर्न।
BGC को मेटाजेनोमिक प्रचुरता यसको बायोसिंथेटिक जीनहरूको औसत प्रचुरताको रूपमा अनुमान गरिएको थियो (जस्तै एन्टि-SMASH द्वारा निर्धारित) जीन-स्तर प्रोफाइलहरूबाट उपलब्ध।प्रत्येक GCF वा GCC को मेटाजेनोमिक प्रचुरतालाई प्रतिनिधि BGC को योगफलको रूपमा गणना गरियो (१७,६८९ मध्ये)।यी प्रचुरता नक्साहरू पछि प्रति-नमूना एमओटीयू गणना प्रयोग गरेर सेलुलर संरचनाको लागि सामान्यीकृत गरियो, जसले अनुक्रम प्रयासहरू (विस्तारित डेटा, चित्र 1d) को लागि पनि लेखेको थियो।GCF वा GCC को प्रचलन प्रशस्त मात्रामा > ० भएको नमूनाहरूको प्रतिशतको रूपमा गणना गरिएको थियो।
नमूनाहरू बीचको इक्लिडियन दूरी सामान्यीकृत GCF प्रोफाइलबाट गणना गरिएको थियो।यी दूरीहरू UMAP77 को प्रयोग गरेर आकारमा घटाइएका थिए र परिणामस्वरूप इम्बेडिङहरू HDBSCAN78 को प्रयोग गरेर असुरक्षित घनत्व-आधारित क्लस्टरिङका लागि प्रयोग गरियो।HDBSCAN द्वारा प्रयोग गरिएको क्लस्टर (र त्यसकारण क्लस्टरहरूको संख्या) को लागि इष्टतम न्यूनतम अंकहरूको संख्या क्लस्टर सदस्यताको संचयी सम्भावनालाई अधिकतम गरेर निर्धारण गरिन्छ।पहिचान गरिएका क्लस्टरहरू (र यी क्लस्टरहरूको अनियमित सन्तुलित सबसम्पलमा पूर्वाग्रहको लागि परम्युटेसनल बहुभिन्नता विश्लेषण (PERMANOVA)) PERMANOVA प्रयोग गरेर अपरिमित इक्लिडियन दूरीहरू विरुद्ध महत्त्वको लागि परीक्षण गरिएको थियो।नमूनाहरूको औसत जीनोम आकार MOTU को सापेक्ष प्रशस्तता र जीनोमका सदस्यहरूको अनुमानित जीनोम आकारको आधारमा गणना गरिएको थियो।विशेष गरी, प्रत्येक एमओटीयूको औसत जीनोम आकार यसको सदस्यहरूको जीनोम आकारहरूको औसतको रूपमा अनुमान गरिएको थियो जुन पूर्णता (फिल्टरिङ पछि) को लागि सही गरिएको थियो (उदाहरणका लागि, 3 Mb को लम्बाइ भएको 75% पूर्ण जीनोमको 4 को समायोजित आकार हुन्छ। Mb)।अखण्डता ≥70% संग मध्यम जीनोमहरूको लागि।प्रत्येक नमूनाको लागि औसत जीनोम आकार त्यसपछि सापेक्षिक प्रशस्तता द्वारा भारित MOTU जीनोम आकारहरूको योगको रूपमा गणना गरिएको थियो।
OMD मा जीनोम-इन्कोड गरिएको BGCs को एक फिल्टर गरिएको सेट ब्याक्टेरियल र पुरातात्विक GTDB रूखहरूमा देखाइएको छ (≥5 kb फ्रेमवर्कमा, REF र SAG MarDB बाहेक 1038 मेटाजेनोमहरूमा फेला परेन, माथि हेर्नुहोस्) र तिनीहरूको अनुमानित उत्पादन कोटिहरू फिजेनेटिकको आधारमा। जीनोम को स्थिति (माथि हेर्नुहोस्)।हामीले सबैभन्दा पहिले ती प्रजातिहरूमा सबैभन्दा धेरै BGC हरू भएका जीनोमलाई प्रतिनिधिको रूपमा प्रयोग गरेर प्रजातिहरूद्वारा डाटा घटायौं।भिजुअलाइजेसनको लागि, प्रतिनिधिहरूलाई थप रूख समूहहरूमा विभाजन गरिएको थियो, र फेरि, प्रत्येक सेल क्लेडको लागि, सबैभन्दा ठूलो संख्या BGCs भएको जीनोमलाई प्रतिनिधिको रूपमा चयन गरिएको थियो।BGC-समृद्ध प्रजातिहरू (>15 BGCs भएको कम्तिमा एउटा जीनोम) ती BGC हरूमा इन्कोड गरिएका उत्पादन प्रकारहरूको लागि श्यानन विविधता सूचकांक गणना गरेर थप विश्लेषण गरियो।यदि सबै अनुमानित उत्पादन प्रकारहरू समान छन् भने, रासायनिक हाइब्रिडहरू र अन्य जटिल BGCs (एन्टी-SMAH द्वारा भविष्यवाणी गरिए अनुसार) समान उत्पादन प्रकारका मानिन्छन्, क्लस्टरमा तिनीहरूको अर्डर (जस्तै प्रोटीन-ब्याक्टेरियोसिन र ब्याक्टेरियोसिन-प्रोटियोप्रोटिन फ्युजन)। जीउ)।हाइब्रिड)।
Malaspina नमूना MP1648 बाट बाँकी DNA (अनुमानित 6 ng), जैविक नमूना SAMN05421555 सँग मिल्दोजुल्दो र छोटो पढ्नको लागि Illumina SRR3962772 मेटाजेनोमिक रिड सेटसँग मेल खान्छ, PacBio अनुक्रमण प्रोटोकल अनुसार प्रशोधन गरिएको छ। किट (100-980-000) र SMRTbell एक्सप्रेस 2.0 टेम्प्लेट तयारी किट (100-938-900)।छोटकरीमा, बाँकी डीएनए कोभेरिस (g-TUBE, 52104) को प्रयोग गरेर काटिएको, मर्मत र शुद्ध (ProNex beads) गरिएको थियो।शुद्ध DNA त्यसपछि पुस्तकालय तयारी, प्रवर्धन, शुद्धीकरण (ProNex मोती) र साइज चयन (>6 kb, ब्लू पिपिन) अन्तिम शुद्धिकरण चरण (ProNex मोती) अघि र सिक्वेल II प्लेटफर्ममा अनुक्रमणको अधीनमा हुन्छ।
पहिलो दुई सीए को पुनर्निर्माण।MAG Eremiobacterota को लागि, हामीले छवटा अतिरिक्त ANIs > 99% (यी चित्र 3 मा समावेश छन्) पहिचान गर्यौं, जुन प्रारम्भिक रूपमा प्रदूषण स्कोरको आधारमा फिल्टर गरिएको थियो (पछि जीन डुप्लिकेशनको रूपमा पहिचान गरियो, तल हेर्नुहोस्)।हामीले "Ca" लेबल गरिएको ट्रे पनि भेट्टायौं।Eremiobacterota" विभिन्न अध्ययनहरूबाट23 र तिनीहरूलाई हाम्रो अध्ययनका आठ MAGs सँग 633 युकेरियोटिक समृद्ध (>0.8 µm) नमूनाहरू BWA (v.0.7.17) Ref -r1188, – एक झण्डा) डाउनसम्पलको लागि प्रयोग गरेर मेटाजेनोमिक पढ्नको लागि सन्दर्भको रूपमा प्रयोग गरियो। नक्साङ्कन (5 मिलियन पढ्ने)।संवर्धन-विशिष्ट नक्साहरूमा आधारित (95% पङ्क्तिबद्ध पहिचान र 80% पढिएको कभरेजद्वारा फिल्टर गरिएको), 10 मेटाजेनोमहरू (अपेक्षित कभरेज ≥5×) एसेम्बलीका लागि र थप 49 मेटाजेनोमहरू (अपेक्षित कभरेज ≥1×) सामग्रीको सम्बन्धका लागि चयन गरियो।माथिको जस्तै समान प्यारामिटरहरू प्रयोग गरेर, यी नमूनाहरू binned गरियो र 10 अतिरिक्त 'Ca' थपियो।MAG Eremiobacterota पुनर्स्थापित गरिएको छ।यी 16 MAGs (डेटाबेसमा पहिले नै दुई गन्ती नगरिएको) ले विस्तारित OMD मा जीनोमहरूको कुल संख्या 34,815 मा ल्याउँछ।MAGs लाई तिनीहरूको जीनोमिक समानता र GTDB मा स्थितिको आधारमा वर्गीकरण श्रेणी तोकिएको छ।18 MAG हरू dRep प्रयोग गरेर 5 प्रजातिहरू (intraspecific ANI > 99%) र 3 genera (intrageneric ANI 85% देखि 94%) मा एउटै परिवार79 मा घटाइएको थियो।प्रजाति प्रतिनिधिहरू म्यानुअल रूपमा अखण्डता, प्रदूषण, र N50 को आधारमा चयन गरिएको थियो।सुझाव गरिएको नामकरण पूरक जानकारीमा प्रदान गरिएको छ।
'Ca को अखण्डता र प्रदूषणको मूल्याङ्कन गर्नुहोस्।MAG Eremiobacterota, हामीले uscMG को उपस्थिति, साथै वंश- र डोमेन-विशिष्ट एकल-प्रतिलिपि मार्कर जीन सेटहरू CheckM र Anvi'o द्वारा प्रयोग गरेको मूल्याङ्कन गर्यौं।40 uscMGs मध्ये 2 डुप्लिकेटहरूको पहिचान फाइलोजेनेटिक पुनर्निर्माण (तल हेर्नुहोस्) द्वारा पुष्टि गरिएको थियो कुनै पनि सम्भावित प्रदूषण (यो यी 40 मार्कर जीनहरूमा आधारित 5% सँग मेल खान्छ)।पाँच प्रतिनिधि MAGs 'Ca को एक अतिरिक्त अध्ययन।प्रचुरता र अनुक्रम संरचना सहसंबंध (पूरक जानकारी) 59 मा आधारित अन्तरक्रियात्मक Anvi'o इन्टरफेस प्रयोग गरेर Eremiobacterota प्रजातिहरूको लागि यी पुनर्गठित जीनोमहरूमा प्रदूषकहरूको निम्न स्तर पुष्टि गरिएको थियो।
फिलोजेनोमिक विश्लेषणको लागि, हामीले पाँच प्रतिनिधि MAGs "Ca" चयन गर्यौं।Eudormicrobiaceae", सबै प्रजाति "Ca।Eremiobacterota को जीनोम र अन्य phyla को सदस्यहरु (UBP13, Armatimonadota, Patescibacteria, Dormibacterota, Chloroflexota, Cyanobacteria, Actinobacteria र Planctomycetota सहित) GTDB (r89)13 बाट उपलब्ध छ।यी सबै जीनोमहरू पहिले एकल प्रतिलिपि मार्कर जीन निकासी र BGC एनोटेसनको लागि वर्णन गरिए अनुसार एनोटेट गरिएको थियो।GTDB जीनोमहरू माथिको अखण्डता र प्रदूषण मापदण्ड अनुसार संरक्षित गरिएको थियो।Phylogenetic विश्लेषण Anvi'o Phylogenetics59 कार्यप्रवाह प्रयोग गरेर प्रदर्शन गरिएको थियो।रूख IQTREE (v.2.0.3) (पूर्वनिर्धारित विकल्पहरू र -bb 1000) 80 प्रयोग गरेर Anvi'o (MUSCLE, v.3.8.1551)81 द्वारा पहिचान गरिएको 39 ट्यान्डम राइबोसोमल प्रोटीनहरूको पङ्क्तिबद्धतामा निर्माण गरिएको थियो।उनको पद घटाइयो।जीनोम ८२ को कम्तिमा ५०% कभर गर्न र GTDB रूख टोपोलोजीमा आधारित आउटसमूहको रूपमा प्लान्क्टोमाइसेकोटा प्रयोग गरिएको थियो।40 uscMGs को एउटा रूख उही उपकरण र मापदण्डहरू प्रयोग गरेर निर्माण गरिएको थियो।
हामीले सामान्य माइक्रोबियल लक्षणहरू भविष्यवाणी गर्न पूर्वनिर्धारित प्यारामिटरहरू (फेनोटाइप, न्यूक्लियोटाइडहरूबाट) 83 सँग Traitar (v.1.1.2) प्रयोग गर्यौं।हामीले पहिले विकसित शिकारी अनुक्रमणिका 84 मा आधारित एक सम्भावित शिकारी जीवनशैली अन्वेषण गर्यौं जुन जीनोममा प्रोटीन-कोडिङ जीनको सामग्रीमा निर्भर गर्दछ।विशेष रूपमा, हामीले DIAMOND लाई OrthoMCL डाटाबेस (v.4)85 विरुद्ध जीनोममा प्रोटिनहरू तुलना गर्न विकल्पहरू प्रयोग गर्छौं -अधिक-संवेदनशील -आईडी 25 -क्वेरी-कभर 70 -विषय-कभर 70 -शीर्ष 20 र सम्बन्धित जीनहरू गणना गर्नुहोस्। सिकारी र गैर-शिकारीहरूको लागि मार्कर जीन।सूचकांक शिकारी र गैर-शिकारी चिन्हहरूको संख्या बीचको भिन्नता हो।अतिरिक्त नियन्त्रणको रूपमा, हामीले "Ca" जीनोमलाई पनि विश्लेषण गर्यौं।Entotheonella TSY118 कारक Ca सँग यसको सम्बन्धमा आधारित छ।Eudoremicrobium (ठूलो जीनोम आकार र बायोसिंथेटिक क्षमता)।अर्को, हामीले शिकारी र गैर-शिकारी मार्कर जीनहरू र Ca को बायोसिंथेटिक क्षमता बीचको सम्भावित लिङ्कहरू परीक्षण गर्यौं।Eudormicrobiaceae" र पत्ता लगायो कि एक भन्दा बढी जीन (कुनै पनि प्रकारको मार्कर जीनबाट, अर्थात् शिकारी/गैर-शिकारी जीन) BGC सँग ओभरल्याप गर्दैन, सुझाव दिन्छ कि BGC ले शिकार संकेतहरूलाई भ्रमित गर्दैन।स्क्र्याम्बल गरिएको प्रतिकृतिहरूको अतिरिक्त जीनोमिक एनोटेसन TXSSCAN (v.1.0.2) को प्रयोग गरेर विशेष रूपमा स्राव प्रणाली, पिली, र फ्ल्यागेला86 को जाँच गर्न प्रदर्शन गरिएको थियो।
तारा महासागरहरू 22,40,87 (BWA, v.0.7.17-r1188, -a फ्ल्याग प्रयोग गरेर) को प्रोकारियोटिक र युकेरियोटिक संवर्धन अंशहरूबाट 623 मेटाट्रान्सक्रिप्टोमहरू म्याप गरेर पाँच प्रतिनिधि 'Ca' लाई म्याप गरिएको थियो।Eudormicrobiaceae जीनोम।BAM फाइलहरू FeatureCounts (v.2.0.1) 88 बाट 80% पढ्ने कभरेज र 95% पहिचान फिल्टरिङ पछि प्रशोधन गरिएको थियो (विकल्प सुविधाकाउन्टहरू -प्राथमिक -O -fraction -t CDS,tRNA -F GTF -g ID -p संग) गणना गर्दछ। प्रति जीन सम्मिलितहरूको संख्या।उत्पन्न गरिएका नक्साहरू जीन लम्बाइ र मार्कर जीन प्रचुरता mOTU (सम्मिलित गणना> 0 संग जीनहरूको लागि लम्बाइ-सामान्यीकृत औसत सम्मिलन गणना) को लागि सामान्यीकृत गरिएको थियो र प्रत्येक जीन स्तरको प्रति सेल सापेक्ष अभिव्यक्ति प्राप्त गर्न 22.74 मा लग-रूपान्तरण गरियो, जसले पनि व्याख्या गर्दछ। अनुक्रमणको समयमा नमूनाबाट नमूनामा परिवर्तनशीलता।त्यस्ता अनुपातहरूले तुलनात्मक विश्लेषणको लागि अनुमति दिन्छ, सापेक्षिक प्रचुरता डेटा प्रयोग गर्दा संरचना समस्याहरू कम गर्दछ।जीनोमको पर्याप्त ठूलो भाग पत्ता लगाउन अनुमति दिन थप विश्लेषणको लागि 10 MOTU मार्कर जीनहरू मध्ये 5 को साथ मात्र नमूनाहरू विचार गरियो।
'Ca को सामान्यीकृत ट्रान्सक्रिप्टोम प्रोफाइल।E. taraoceanii लाई UMAP को प्रयोग गरेर आयामिकता घटाउनको लागि प्रयोग गरिएको थियो र नतीजाको प्रतिनिधित्व HDBSCAN (माथि हेर्नुहोस्) को प्रयोग गरी असुरक्षित क्लस्टरिङको लागि अभिव्यक्ति स्थिति निर्धारण गर्न प्रयोग गरिएको थियो।PERMANOVA ले मूल (कम गरिएको छैन) दूरी स्थानमा पहिचान गरिएका क्लस्टरहरू बीचको भिन्नताहरूको महत्त्व परीक्षण गर्दछ।यी अवस्थाहरू बीचको भिन्नता अभिव्यक्ति जीनोम (माथि हेर्नुहोस्) मा परीक्षण गरिएको थियो र 201 KEGG मार्गहरू 6 कार्यात्मक समूहहरूमा पहिचान गरिएको थियो, जस्तै: BGC, स्राव प्रणाली र TXSSCAN बाट फ्ल्यागेलर जीनहरू, डिग्रेडेसन इन्जाइमहरू (प्रोटीज र पेप्टिडेसेस), र शिकारी र गैर- शिकारी जीन।शिकारी सूचकांक मार्कर।प्रत्येक नमूनाको लागि, हामीले प्रत्येक वर्गको लागि मध्य सामान्यीकृत अभिव्यक्ति गणना गर्‍यौं (ध्यान दिनुहोस् कि BGC अभिव्यक्ति आफैं BGC को लागि बायोसिंथेटिक जीनको मध्य अभिव्यक्तिको रूपमा गणना गरिएको छ) र राज्यहरूमा महत्त्वको लागि परीक्षण गरियो (FDR का लागि क्रस्कल-वालिस परीक्षण समायोजित)।
सिंथेटिक जीनहरू जेनस्क्रिप्टबाट र पीसीआर प्राइमरहरू माइक्रोसिन्थबाट खरिद गरिएका थिए।थर्मो फिशर साइन्टिफिकबाट फ्युजन पोलिमरेज डीएनए प्रवर्धनको लागि प्रयोग गरिएको थियो।माचेरी-नागेलबाट न्यूक्लियोस्पिन प्लाज्मिड, न्यूक्लियोस्पिन जेल र पीसीआर शुद्धिकरण किट डीएनए शुद्धीकरणको लागि प्रयोग गरियो।प्रतिबन्ध इन्जाइमहरू र T4 DNA ligase नयाँ इङ्गल्याण्ड Biolabs बाट खरिद गरिएको थियो।isopropyl-β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG) (Biosynth) र 1,4-dithiothreitol (DTT, AppliChem) बाहेक अन्य रसायनहरू सिग्मा-एल्ड्रिचबाट खरिद गरिएका थिए र थप शुद्धीकरण बिना प्रयोग गरियो।एन्टिबायोटिक्स क्लोराम्फेनिकोल (Cm), स्पेक्टिनोमाइसिन डाइहाइड्रोक्लोराइड (Sm), एम्पिसिलिन (Amp), gentamicin (Gt), र कार्बेनिसिलिन (Cbn) AppliChem बाट खरिद गरिएको थियो।ब्याक्टो ट्रिप्टोन र ब्याक्टो यीस्ट एक्स्ट्र्याक्ट मिडिया कम्पोनेन्टहरू बीडी बायोसाइन्सबाट खरिद गरिएको थियो।अनुक्रमका लागि ट्रिप्सिन प्रोमेगाबाट खरिद गरिएको थियो।
जीन अनुक्रमहरू एन्टि-SMASH भविष्यवाणी गरिएको BGC 75.1 बाट निकालिएको थियो।E. malaspinii (पूरक जानकारी)।
जीनहरू embA (locus, MALA_SAMN05422137_METAG-framework_127-gene_5), embM (locus, MALA_SAMN05422137_METAG-framework_127-gene_4), र embAM (intergene क्षेत्रहरू सहित) लाई pU57 को सिन्थेटिक र सिन्थआरडोन बिना सिन्थरेन्सको रूपमा कन्स्ट्रक्ट थियो। s E मा अभिव्यक्तिको लागि अनुकूलित कहिले।एम्बा जीनलाई pACYCDuet-1(CmR) र pCDFDuet-1(SmR) को पहिलो मल्टिपल क्लोनिङ साइट (MCS1) मा BamHI र HindIII क्लीभेज साइटहरूमा सबक्लोन गरिएको थियो।embM र embMopt जीनहरू (कोडन-अनुकूलित) MCS1 pCDFDuet-1 (SmR) मा BamHI र HindIII सँग सबक्लोन गरिएको थियो र pCDFDuet-1 (SmR) र pRSFDuet-1 (KanR) (MCS2) को दोस्रो बहु क्लोनिङ साइटमा राखिएको थियो। NdeI/ChoI।embAM क्यासेटलाई pCDFDuet1(SmR) मा BamHI र HindIII क्लीभेज साइटहरू सहित सबक्लोन गरिएको थियो।orf3/embI जीन (locus, MALA_SAMN05422137_METAG-scaffold_127-gene_3) लाई ओभरल्याप एक्सटेन्सन PCR द्वारा EmbI_OE_F_NdeI र EmbI_OE_R_XhoI, Nde-MBT1-121137 मा पचाइएको प्राइमरहरू प्रयोग गरेर निर्माण गरिएको थियो। ) समान प्रतिबन्ध इन्जाइमहरू प्रयोग गरेर (पूरक तालिका)।६)।प्रतिबन्ध इन्जाइम पाचन र ligation निर्माताको प्रोटोकल (न्यु इङ्गल्याण्ड Biolabs) अनुसार प्रदर्शन गरिएको थियो।