304 स्टेनलेस स्टील कोइल ट्युबिङ रासायनिक कम्पोनेन्ट, SPACA6 ectodomain को संरचनाले गेमेट फ्युजनसँग सम्बन्धित प्रोटिनहरूको संरक्षित सुपरपरिवार समावेश गर्दछ।

Nature.com भ्रमण गर्नुभएकोमा धन्यवाद।तपाईं सीमित CSS समर्थनको साथ ब्राउजर संस्करण प्रयोग गर्दै हुनुहुन्छ।उत्तम अनुभवको लागि, हामी तपाईंलाई अपडेट गरिएको ब्राउजर प्रयोग गर्न सिफारिस गर्छौं (वा इन्टरनेट एक्सप्लोररमा अनुकूलता मोड असक्षम गर्नुहोस्)।थप रूपमा, निरन्तर समर्थन सुनिश्चित गर्न, हामी शैलीहरू र जाभास्क्रिप्ट बिना साइट देखाउँछौं।
स्लाइडरहरू प्रति स्लाइड तीन लेखहरू देखाउँदै।स्लाइडहरू मार्फत सार्नको लागि पछाडि र अर्को बटनहरू प्रयोग गर्नुहोस्, वा प्रत्येक स्लाइडमा सार्नको लागि अन्तमा स्लाइड नियन्त्रक बटनहरू प्रयोग गर्नुहोस्।

SPACA6 एक शुक्राणु-अभिव्यक्त सतह प्रोटीन हो जुन स्तनधारी यौन प्रजनन को समयमा गेमेट फ्यूजन को लागी महत्वपूर्ण छ।यस मौलिक भूमिकाको बावजुद, SPACA6 को विशिष्ट प्रकार्य खराब रूपमा बुझिएको छ।हामी 2.2 Å को रिजोल्युसनमा SPACA6 को एक्स्ट्रासेल्युलर डोमेनको क्रिस्टल संरचनालाई स्पष्ट गर्छौं, चार-स्ट्र्यान्डेड बन्डल र Ig-जस्तो β-स्यान्डविचहरू अर्ध-लचिलो लिङ्करहरूद्वारा जोडिएको दुई-डोमेन प्रोटीन प्रकट गर्दै।यो संरचना IZUMO1 सँग मिल्दोजुल्दो छ, अर्को गेमेट फ्युजन-सम्बन्धित प्रोटीन, जसले SPACA6 र IZUMO1 लाई निषेचन-सम्बद्ध प्रोटीनहरूको सुपरफैमिलीको संस्थापक सदस्यहरू बनाउँछ जसलाई यहाँ IST सुपरफैमिली भनिन्छ।IST सुपरफैमिली संरचनात्मक रूपमा यसको ट्विस्टेड फोर-हेलिक्स बन्डल र डाइसल्फाइड-लिङ्क गरिएको CXXC मोटिफहरूद्वारा परिभाषित गरिएको छ।मानव प्रोटोमको संरचनामा आधारित अल्फाफोल्ड खोजले यस अतिपरिवारका अतिरिक्त प्रोटीन सदस्यहरू पहिचान गर्‍यो;विशेष गरी, यी धेरै प्रोटीनहरू गेमेट फ्यूजनमा संलग्न छन्।SPACA6 संरचना र IST का अन्य सदस्यहरूसँगको सम्बन्धले स्तनधारी गेमेट फ्युजनको हाम्रो ज्ञानमा हराइरहेको लिङ्क प्रदान गर्दछ।
प्रत्येक मानव जीवन दुई अलग-अलग ह्याप्लोइड गेमेटहरूबाट सुरु हुन्छ: बुबाको शुक्राणु र आमाको अण्डा।यो शुक्राणु एक गहन छनोट प्रक्रियाको विजेता हो जसमा लाखौं शुक्राणु कोशिकाहरू महिलाको जननमार्गबाट ​​गुज्र्छन्, विभिन्न अवरोधहरू पार गर्छन् र क्यापेसिटेशनबाट गुज्र्छन्, जसले तिनीहरूको गतिशीलता र सतहका घटकहरूको प्रक्रियालाई बढाउँछ 2,3,4।यदि शुक्राणु र oocyte एक अर्कालाई फेला पारे पनि, प्रक्रिया अझै समाप्त भएको छैन।oocyte क्यूमुलस कोशिकाहरूको एक तह र जोना पेलुसिडा भनिने ग्लाइकोप्रोटिन बाधाले घेरिएको हुन्छ, जसको माध्यमबाट शुक्राणु oocyte मा प्रवेश गर्न को लागी जानु पर्छ।स्पर्मेटोजोआले यी अन्तिम बाधाहरूलाई पार गर्न सतह आसंजन अणुहरू र झिल्ली-सम्बन्धित र स्रावित इन्जाइमहरूको संयोजन प्रयोग गर्दछ।यी अणुहरू र इन्जाइमहरू मुख्यतया भित्री झिल्ली र एक्रोसोमल म्याट्रिक्समा भण्डारण गरिन्छन् र जब शुक्राणुको बाहिरी झिल्ली एक्रोसोमल प्रतिक्रियाको समयमा लाइसेड हुन्छ पत्ता लगाइन्छ।यस गहन यात्राको अन्तिम चरण भनेको शुक्राणु-अण्डाको फ्युजन घटना हो, जसमा दुई कोशिकाहरूले आफ्नो झिल्लीलाई एकल डिप्लोइड जीव बन्नको लागि फ्यूज गर्छन्।यद्यपि यो प्रक्रिया मानव प्रजननमा ग्राउन्डब्रेकिङ हो, आवश्यक आणविक अन्तरक्रियाहरू नराम्ररी बुझिएका छन्।
गेमेटहरूको निषेचनको अतिरिक्त, दुई लिपिड बिलेयरहरूको फ्यूजनको रसायन विज्ञानको व्यापक रूपमा अध्ययन गरिएको छ।सामान्यतया, झिल्ली फ्युजन एक ऊर्जावान प्रतिकूल प्रक्रिया हो जसलाई संरचनात्मक रूपान्तरण परिवर्तन गर्न प्रोटीन उत्प्रेरकको आवश्यकता पर्दछ जसले दुई झिल्लीहरूलाई एकसाथ नजिक ल्याउँछ, तिनीहरूको निरन्तरता तोड्छ र फ्यूजन 8,9 निम्त्याउँछ।यी प्रोटीन उत्प्रेरकहरू fusogens को रूपमा चिनिन्छन् र अनगिन्ती फ्यूजन प्रणालीहरूमा पाइन्छ।तिनीहरू होस्ट कोशिकाहरूमा भाइरल प्रवेशको लागि आवश्यक छन् (जस्तै, HIV-1 मा gp160, कोरोनाभाइरसमा स्पाइक, इन्फ्लुएन्जा भाइरसहरूमा हेमाग्ग्लुटिनिन) 10,11,12 प्लेसेन्टल (syncytin) 13,14,15 र तल्लो युकेरियोटहरूमा गेमेट-फर्मिंग फ्यूजनहरू ( HAP2/GCS1 बिरुवा, प्रोटिस्ट र आर्थ्रोपोडमा) 16,17,18,19।मानव गेमेटहरूका लागि फ्युसोजेनहरू अझै पत्ता लाग्न सकेको छैन, यद्यपि धेरै प्रोटीनहरू गेमेट संलग्नक र फ्यूजनको लागि महत्वपूर्ण देखाइएको छ।oocyte-expressed CD9, माउस र मानव गेमेटहरूको फ्यूजनको लागि आवश्यक ट्रान्समेम्ब्रेन प्रोटीन, 21,22,23 पत्ता लगाउने पहिलो थियो।यद्यपि यसको सटीक कार्य अस्पष्ट रहन्छ, आसंजनमा भूमिका, अण्डा माइक्रोभिलीमा आसंजन फोसीको संरचना, र/वा ओसाइट सतह प्रोटीनहरूको सही स्थानीयकरण सम्भवतः 24,25,26 देखिन्छ।गेमेट फ्युजनका लागि महत्वपूर्ण दुईवटा सामान्य प्रोटीनहरू शुक्राणु प्रोटीन IZUMO127 र oocyte प्रोटीन JUNO28 हुन्, र तिनीहरूको आपसी सम्बन्ध फ्यूजन हुनु अघि गेमेट पहिचान र आसंजनमा महत्त्वपूर्ण चरण हो।पुरुष इजुमो १ नकआउट मुसा र महिला जुनो नकआउट मुसाहरू पूर्ण रूपमा बाँझ हुन्छन्, यी मोडेलहरूमा शुक्रकीट पेरिभिटेललाइन स्पेसमा प्रवेश गर्दछ तर गेमेटहरू फ्युज गर्दैनन्।त्यसैगरी, एन्टी-IZUMO1 वा JUNO27,29 एन्टिबडीहरू मानव इन भिट्रो निषेचन प्रयोगहरूमा ग्यामेटहरूलाई उपचार गर्दा संगम कम भयो।
भर्खरै, IZUMO1 र JUNO20,30,31,32,33,34,35 सँग मिल्दोजुल्दो शुक्राणु-अभिव्यक्त प्रोटीनहरूको नयाँ पत्ता लागेको समूह पत्ता लागेको छ।शुक्राणु एक्रोसोमल मेम्ब्रेन-सम्बन्धित प्रोटीन 6 (SPACA6) लाई ठूलो मात्रामा म्युरिन म्युटाजेनेसिस अध्ययनमा निषेचनका लागि आवश्यकको रूपमा पहिचान गरिएको छ।Spaca6 जीनमा ट्रान्सजीन सम्मिलित गर्दा ननफ्युसिबल स्पर्मेटोजोआ उत्पादन हुन्छ, यद्यपि यी शुक्राणुहरूले पेरिभिटेललाइन स्पेस 36 मा घुसपैठ गर्छन्।मुसामा पछिल्ला नकआउट अध्ययनहरूले पुष्टि गर्‍यो कि गेमेट फ्युजन 30,32 को लागि Spaca6 आवश्यक छ।SPACA6 लगभग विशेष रूपमा अण्डकोषहरूमा व्यक्त गरिन्छ र IZUMO1 को जस्तै स्थानीयकरण ढाँचा छ, अर्थात् एक्रोसोमल प्रतिक्रिया अघि शुक्राणुको इन्टिमा भित्र, र त्यसपछि एक्रोसोमल प्रतिक्रिया 30,32 पछि भूमध्यवर्ती क्षेत्रमा माइग्रेट हुन्छ।Spaca6 homologues विभिन्न स्तनधारी प्राणीहरू र अन्य eukaryotes 30 मा अवस्थित छ र मानव गेमेट फ्यूजनको लागि यसको महत्त्व SPACA6 30 को प्रतिरोधद्वारा भिट्रोमा मानव निषेचनको अवरोधद्वारा प्रदर्शन गरिएको छ।IZUMO1 र JUNO को विपरीत, SPACA6 को संरचना, अन्तरक्रिया र कार्यको विवरण अस्पष्ट रहन्छ।
मानव शुक्रकीट र अण्डाको फ्युजनको आधारभूत प्रक्रियालाई अझ राम्ररी बुझ्नको लागि, जसले हामीलाई परिवार नियोजन र प्रजनन उपचारमा भविष्यका विकासहरू सूचित गर्न सक्षम बनाउँछ, हामीले SPACA6 संरचनात्मक र जैव रासायनिक अध्ययनहरू सञ्चालन गर्यौं।SPACA6 को एक्स्ट्रासेलुलर डोमेनको क्रिस्टल संरचनाले चार-हेलिकल बन्डल (4HB) र इम्युनोग्लोबुलिन-जस्तै (Ig-like) डोमेन अर्ध-लचिलो क्षेत्रहरूद्वारा जोडिएको देखाउँछ।अघिल्लो अध्ययनहरूमा भविष्यवाणी गरिए अनुसार, 7,32,37 SPACA6 को डोमेन संरचना मानव IZUMO1 सँग मिल्दोजुल्दो छ, र दुई प्रोटीनहरूले एक असामान्य रूप साझा गर्दछ: 4HB त्रिकोणीय हेलिकल सतह र डाइसल्फाइड-लिंक गरिएको CXXC मोटिफहरूको जोडीको साथ।हामी प्रस्ताव गर्छौं कि IZUMO1 र SPACA6 ले अब गेमेट फ्युजनसँग सम्बन्धित प्रोटीनहरूको ठूलो, संरचनात्मक रूपमा सम्बन्धित सुपरपरिवार परिभाषित गर्दछ।अतिपरिवारका लागि अद्वितीय सुविधाहरू प्रयोग गरेर, हामीले अल्फाफोल्ड संरचनात्मक मानव प्रोटोमको लागि विस्तृत खोजी गरेका थियौं, यस सुपरपरिवारका अतिरिक्त सदस्यहरू पहिचान गर्दै, गेमेट फ्युजन र/वा निषेचनमा संलग्न धेरै सदस्यहरू सहित।यो अब देखिन्छ कि त्यहाँ सामान्य संरचनात्मक तह र ग्यामेट फ्यूजनसँग सम्बन्धित प्रोटीनहरूको सुपरफैमिली छ, र हाम्रो संरचनाले मानव गेमेट फ्यूजन संयन्त्रको यो महत्त्वपूर्ण पक्षको आणविक नक्सा प्रदान गर्दछ।
SPACA6 एकल-पास ट्रान्समेम्ब्रेन प्रोटीन हो जसमा एक एन-लिंक गरिएको ग्लाइकन र छ वटा पुटेटिभ डाइसल्फाइड बन्डहरू छन् (चित्र S1a र S2)।हामीले ड्रोसोफिला S2 कोशिकाहरूमा मानव SPACA6 (अवशेषहरू 27-246) को बाह्य कोशिकी डोमेन व्यक्त गर्‍यौं र निकेल एफिनिटी, क्यासन एक्सचेन्ज, र साइज बहिष्कार क्रोमेटोग्राफी (चित्र S1b) प्रयोग गरेर प्रोटीन शुद्ध गर्‍यौं।शुद्ध SPACA6 ectodomain धेरै स्थिर र एकरूप छ।बहुभुज प्रकाश स्क्याटरिङ (SEC-MALS) सँग मिलाएर साइज एक्सक्लुजन क्रोमाटोग्राफी प्रयोग गरी विश्लेषणले २६.२ ± ०.५ kDa (चित्र S1c) को गणना गरिएको आणविक तौल भएको एउटा शिखर पत्ता लगायो।यो SPACA6 monomeric ectodomain को आकार संग संगत छ, oligomerization शुद्धीकरण को समयमा देखा परेन भनेर संकेत गर्दछ।थप रूपमा, गोलाकार डाइक्रोइज्म (CD) स्पेक्ट्रोस्कोपीले 51.3 °C (Fig. S1d,e) को पिघलने बिन्दुको साथ मिश्रित α/β संरचना प्रकट गर्‍यो।CD स्पेक्ट्राको Deconvolution ले 38.6% α-helical र 15.8% β-stranded तत्वहरू (चित्र S1d) प्रकट गर्यो।
SPACA6 ectodomain लाई 2.2 Å (तालिका 1 र चित्र S3) को रिजोल्युसनको साथ डेटा सेटको परिणाम स्वरूप अनियमित म्याट्रिक्स सिडिङ38 प्रयोग गरेर क्रिस्टलाइज गरिएको थियो।संरचना निर्धारणको लागि ब्रोमाइड एक्सपोजरको साथ टुक्रा-आधारित आणविक प्रतिस्थापन र SAD चरणबद्ध डेटाको संयोजन प्रयोग गर्दै (तालिका 1 र चित्र S4), अन्तिम परिष्कृत मोडेलले अवशेषहरू 27-246 समावेश गर्दछ।जब संरचना निर्धारण गरिएको थियो, त्यहाँ कुनै प्रयोगात्मक वा अल्फाफोल्ड संरचनाहरू उपलब्ध थिएनन्।SPACA6 ectodomain मापन 20 Å × 20 Å × 85 Å, सात हेलिकेस र नौ β-स्ट्र्यान्डहरू हुन्छन्, र छवटा डाइसल्फाइड बन्डहरू (चित्र 1a, b) द्वारा स्थिर गरिएको लम्बाइ भएको तृतीयक तह हुन्छ।Asn243 साइड चेनको अन्त्यमा कमजोर इलेक्ट्रोन घनत्वले यो अवशेष एन-लिंक गरिएको ग्लाइकोसिलेशन हो भनेर संकेत गर्दछ।संरचनामा दुई डोमेनहरू हुन्छन्: एक N-टर्मिनल चार-हेलिक्स बन्डल (4HB) र तिनीहरू बीचको मध्यवर्ती काज क्षेत्र भएको C-टर्मिनल Ig-जस्तो डोमेन (चित्र 1c)।
SPACA6 को एक्स्ट्रासेलुलर डोमेनको संरचना।SPACA6 को एक्स्ट्रासेलुलर डोमेनको स्ट्रिप आरेख, N देखि C-टर्मिनस सम्मको चेनको रंग गाढा नीलो देखि गाढा रातो सम्म।डाइसल्फाइड बन्डहरूमा संलग्न सिस्टिनहरू म्याजेन्टामा हाइलाइट गरिएका छन्।b SPACA6 को एक्स्ट्रासेलुलर डोमेनको टोपोलजी।चित्र 1a मा जस्तै रङ योजना प्रयोग गर्नुहोस्।c SPACA6 एक्स्ट्रासेलुलर डोमेन।4HB, काज, र Ig-जस्तै डोमेन स्ट्रिप चार्टहरू क्रमशः सुन्तला, हरियो र नीलो रङका छन्।तहहरू मापन गर्न कोरिएका छैनन्।
SPACA6 को 4HB डोमेनले चार मुख्य हेलिकेसहरू (हेलिसेस 1–4) समावेश गर्दछ, जुन एक हेलिकल हेलिक्स (चित्र 2a) को रूपमा व्यवस्थित गरिएको छ, एन्टिपैरलल र समानान्तर अन्तरक्रियाहरू (चित्र 2b) बीचको एकान्तरण।एउटा सानो अतिरिक्त एकल-टर्न हेलिक्स (हेलिक्स 1′) बन्डलमा सीधा राखिएको छ, हेलिकेस 1 र 2 संग त्रिकोण बनाउँछ। यो त्रिकोण हेलिकेस 3 र 4 को अपेक्षाकृत घने प्याकिङको हेलिकल-ट्विस्टेड प्याकिङमा थोरै विकृत हुन्छ ( चित्र 2a)।
4HB N-टर्मिनल स्ट्रिप चार्ट।b चार हेलिक्सको बन्डलको शीर्ष दृश्य, N-टर्मिनसमा गाढा नीलो र C-टर्मिनसमा गाढा रातोमा हाइलाइट गरिएको प्रत्येक हेलिक्स।c 4HB को लागि शीर्ष-डाउन सर्पिल व्हील रेखाचित्र, प्रत्येक अवशेषलाई एकल-अक्षर एमिनो एसिड कोडको साथ लेबल गरिएको सर्कलको रूपमा देखाइएको छ;पाङ्ग्राको शीर्षमा चार एमिनो एसिडहरू मात्र अंकित छन्।गैर-ध्रुवीय अवशेषहरू पहेंलो रंगका हुन्छन्, ध्रुवीय चार्ज नगरिएका अवशेषहरू हरियो रङका हुन्छन्, सकारात्मक रूपमा चार्ज गरिएका अवशेषहरू नीलो रंगका हुन्छन्, र नकारात्मक रूपमा चार्ज गरिएका अवशेषहरू रातो रंगका हुन्छन्।d 4HB डोमेनका त्रिकोणीय अनुहारहरू, 4HB सुन्तला रङमा हरियो रङमा छन्।दुबै इनसेटहरूले रड आकारको डाइसल्फाइड बन्डहरू देखाउँछन्।
4HB भित्री हाइड्रोफोबिक कोरमा केन्द्रित छ जुन मुख्यतया अलिफेटिक र सुगन्धित अवशेषहरू (चित्र 2c) मिलेर बनेको छ।कोरमा Cys41 र Cys55 बीचको डाइसल्फाइड बन्ड हुन्छ जसले हेलिकेस 1 र 2 लाई माथिल्लो उभिएको त्रिकोणमा जोड्दछ (चित्र 2d)।हेलिक्स 1′ मा CXXC मोटिफ र काज क्षेत्र (चित्र 2d) मा β-हेयरपिनको टुप्पोमा फेला परेको अर्को CXXC मोटिफ बीच दुई अतिरिक्त डाइसल्फाइड बन्डहरू बनाइयो।अज्ञात प्रकार्य (Arg37) संग एक रूढ़िवादी arginine अवशेष हेलीस 1′, 1, र 2 द्वारा बनेको खोक्रो त्रिकोण भित्र स्थित छ। Aliphatic कार्बन परमाणु Cβ, Cγ, र Cδ Arg37 हाइड्रोफोबिक कोर संग अन्तरक्रिया गर्दछ, र यसको guanidine समूह चक्रीय रूपमा सर्छ। हेलिकेस 1′ र 1 बीच Thr32 ब्याकबोन र साइड चेन (चित्र S5a, b) बीचको अन्तरक्रिया मार्फत।Tyr34 दुई साना गुहाहरू छोडेर गुफामा फैलिन्छ जसको माध्यमबाट Arg37 ले विलायकसँग अन्तरक्रिया गर्न सक्छ।
Ig-जस्तै β-स्यान्डविच डोमेनहरू प्रोटीनहरूको ठूलो सुपरफैमिली हो जसले हाइड्रोफोबिक कोर 39 मार्फत अन्तरक्रिया गर्ने दुई वा बढी बहु-स्ट्रेन्डेड एम्फिपाथिक β-पानाहरूको साझा विशेषता साझा गर्दछ। SPACA6 को C-टर्मिनल Ig-जस्तो डोमेनको समान ढाँचा छ। र दुई तहहरू हुन्छन् (चित्र S6a)।पाना 1 चार स्ट्र्यान्डहरू (स्ट्र्यान्डहरू D, F, H, र I) को β-पाना हो जहाँ स्ट्र्यान्डहरू F, H, र I एक समानान्तर विरोधी व्यवस्था बनाउँछन्, र स्ट्र्यान्डहरू I र D समानान्तर अन्तरक्रियामा हुन्छन्।तालिका २ एउटा सानो एन्टी-समानान्तर डबल-स्ट्र्यान्डेड बिटा पाना (स्ट्र्यान्ड्स E र G) हो।ई चेनको C-टर्मिनस र H चेनको केन्द्र (Cys170-Cys226) (चित्र S6b) बीचको आन्तरिक डाइसल्फाइड बन्धन देखियो।यो डाइसल्फाइड बन्ड इम्युनोग्लोबुलिन 40,41 को β-स्यान्डविच डोमेनमा डाइसल्फाइड बन्डसँग मिल्दोजुल्दो छ।
चार-स्ट्र्यान्ड β-पाना यसको सम्पूर्ण लम्बाइमा घुम्छ, आकार र इलेक्ट्रोस्टेटिक्समा भिन्न हुने असममित किनारहरू बनाउँछ।पातलो किनारा एक समतल हाइड्रोफोबिक वातावरणीय सतह हो जुन SPACA6 (Fig. S6b,c) मा बाँकी असमान र इलेक्ट्रोस्टेटिकली विविध सतहहरूको तुलनामा फरक देखिन्छ।हाइड्रोफोबिक सतह (चित्र S6c) वरिपरि खुला ब्याकबोन कार्बोनिल/एमिनो समूहहरू र ध्रुवीय साइड चेनहरूको हलो।फराकिलो मार्जिनलाई क्याप गरिएको हेलिकल सेगमेन्टले ढाक्छ जसले हाइड्रोफोबिक कोरको एन-टर्मिनल भागलाई रोक्छ र F चेन ब्याकबोन (चित्र S6d) को खुला ध्रुवीय समूहसँग तीनवटा हाइड्रोजन बन्डहरू बनाउँछ।यस किनाराको सी-टर्मिनल भागले आंशिक रूपमा खुला हाइड्रोफोबिक कोरको साथ ठूलो खल्ती बनाउँछ।दोहोरो आर्जिनिन अवशेषहरू (Arg162-Arg221, Arg201-Arg205 र Arg212-Arg214) र केन्द्रीय हिस्टिडाइन (His220) (चित्र S6e) को तीन सेटका कारण पकेट सकारात्मक चार्जहरूले घेरिएको छ।
काज क्षेत्र हेलिकल डोमेन र Ig-जस्तै डोमेन बीचको छोटो खण्ड हो, जसमा एक विरोधी समानान्तर थ्री-स्ट्र्यान्ड β-लेयर (स्ट्र्यान्ड A, B र C), एउटा सानो 310 हेलिक्स, र धेरै लामो अनियमित हेलिकल खण्डहरू हुन्छन्।(चित्र S7)।काज क्षेत्रमा कोभ्यालेन्ट र इलेक्ट्रोस्ट्याटिक सम्पर्कहरूको नेटवर्कले 4HB र Ig-जस्तो डोमेन बीचको अभिमुखीकरण स्थिर गरेको देखिन्छ।नेटवर्कलाई तीन भागमा विभाजन गर्न सकिन्छ।पहिलो भागमा दुई CXXC मोटिफहरू (27CXXC30 र 139CXXC142) समावेश छन् जसले काजमा रहेको β-हेयरपिन र 4HB मा 1′ हेलिक्स बीचको डाइसल्फाइड बन्धनको एक जोडी बनाउँछ।दोस्रो भागले Ig-like डोमेन र काज बीचको इलेक्ट्रोस्टेटिक अन्तरक्रियाहरू समावेश गर्दछ।काजमा Glu132 ले Ig-like डोमेनमा Arg233 र hing मा Arg135 सँग नुन पुल बनाउँछ।तेस्रो भागले Ig-like डोमेन र काज क्षेत्र बीचको सहसंयोजक बन्धन समावेश गर्दछ।दुई डाइसल्फाइड बन्डहरू (Cys124-Cys147 र Cys128-Cys153) ले हिङ्ग लूपलाई लिङ्करमा जडान गर्दछ जुन Gln131 र ब्याकबोन कार्यात्मक समूह बीचको इलेक्ट्रोस्टेटिक अन्तरक्रियाद्वारा स्थिर हुन्छ, पहिलो Ig-जस्तै डोमेनमा पहुँच गर्न अनुमति दिँदै।चेन।
SPACA6 ectodomain को संरचना र 4HB र Ig-जस्तै डोमेनहरूको व्यक्तिगत संरचनाहरू प्रोटीन डेटाबेस 42 मा संरचनात्मक रूपमा समान रेकर्डहरू खोज्न प्रयोग गरियो।हामीले उच्च Dali Z स्कोरहरू, सानो मानक विचलनहरू, र ठूलो LALI स्कोरहरू (पछिल्लो भनेको संरचनात्मक रूपमा बराबर अवशेषहरूको संख्या हो) सँग मेल खायौं।जबकि पूर्ण ectodomain खोज (तालिका S1) बाट पहिलो 10 हिटहरूको स्वीकार्य Z-स्कोर > 842 थियो, 4HB वा Ig-जस्तो डोमेनको खोजीले मात्र देखाएको छ कि यी हिटहरू मध्ये धेरै जसो β-स्यान्डविचसँग मात्र मेल खान्छ।धेरै प्रोटीनहरूमा पाइने सर्वव्यापी तह।Dali मा भएका सबै तीन खोजहरूले एउटा मात्र नतिजा फर्काए: IZUMO1।
यो लामो समय देखि सुझाव गरिएको छ कि SPACA6 र IZUMO1 साझा संरचनात्मक समानता7,32,37।यद्यपि यी दुई गेमेट फ्युजन-सम्बन्धित प्रोटीनहरूको इक्टोडोमेनले 21% अनुक्रम पहिचान (चित्र S8a) मात्र साझा गर्दछ, जटिल प्रमाण, संरक्षित डाइसल्फाइड बन्ड ढाँचा र SPACA6 मा एक भविष्यवाणी गरिएको C-टर्मिनल Ig-जस्तो डोमेन सहित, प्रारम्भिक प्रयासहरूलाई निर्माण गर्न अनुमति दिईयो। IZUMO1 लाई टेम्प्लेटको रूपमा प्रयोग गरी A को SPACA6 माउसको समरूपता मोडेल।हाम्रो संरचनाले यी भविष्यवाणीहरूलाई पुष्टि गर्छ र समानताको वास्तविक डिग्री देखाउँछ।वास्तवमा, SPACA6 र IZUMO137,43,44 संरचनाहरूले समान दुई-डोमेन आर्किटेक्चर (Fig. S8b) साझा गर्दछ समान 4HB र Ig-जस्तै β-स्यान्डविच डोमेनहरू कब्जा क्षेत्र (Fig. S8c) द्वारा जोडिएको।
IZUMO1 र SPACA6 4HB मा परम्परागत सर्पिल बन्डलहरूबाट सामान्य भिन्नताहरू छन्।सामान्य 4HBs, जस्तै एन्डोसोमल फ्युजन 45,46 मा संलग्न SNARE प्रोटीन कम्प्लेक्सहरूमा पाइने, समान रूपमा दूरीको हेलीसहरू छन् जसले केन्द्रीय अक्ष 47 वरिपरि स्थिर वक्रता कायम राख्छन्। यसको विपरित, IZUMO1 र SPACA6 दुवैमा हेलिकल डोमेनहरू विकृत थिए, चर वक्रतासहित। असमान प्याकिङ (चित्र S8d)।ट्विस्ट, सम्भवतः हेलिकेस १′, १ र २ द्वारा बनेको त्रिकोणको कारणले गर्दा, IZUMO1 र SPACA6 मा राखिएको छ र हेलिक्स 1′ मा उही CXXC मोटिफद्वारा स्थिर गरिएको छ।यद्यपि, SPACA6 (Cys41 र Cys55 covalently helices 1 र 2 लाई माथि जोड्ने) मा पाइने अतिरिक्त डाइसल्फाइड बन्डले त्रिभुज शीर्षमा एक तिखो शीर्ष बनाउँछ, SPACA6 लाई IZUMO1 भन्दा बढी घुमाउरो बनाउँछ, अधिक स्पष्ट गुहा त्रिकोणहरू सहित।थप रूपमा, IZUMO1 सँग SPACA6 मा यस गुहाको केन्द्रमा अवलोकन गरिएको Arg37 को अभाव छ।यसको विपरित, IZUMO1 सँग अलिफेटिक र सुगन्धित अवशेषहरूको अधिक विशिष्ट हाइड्रोफोबिक कोर छ।
IZUMO1 सँग Ig-जस्तो डोमेन छ जसमा डबल-स्ट्र्यान्डेड र पाँच-स्ट्र्यान्डेड β-शीट ४३ हुन्छ।IZUMO1 मा रहेको अतिरिक्त स्ट्र्यान्डले SPACA6 मा रहेको कुण्डललाई प्रतिस्थापन गर्छ, जसले F स्ट्र्यान्डसँग अन्तर्क्रिया गर्दछ स्ट्र्यान्डमा ब्याकबोन हाइड्रोजन बन्डहरू सीमित गर्न।तुलनाको एउटा चाखलाग्दो बिन्दु दुई प्रोटीनहरूको Ig-जस्तै डोमेनहरूको भविष्यवाणी गरिएको सतह चार्ज हो।IZUMO1 सतह SPACA6 सतह भन्दा बढी नकारात्मक रूपमा चार्ज गरिएको छ।एक अतिरिक्त चार्ज शुक्राणु झिल्ली सामना C-टर्मिनस नजिकै स्थित छ।SPACA6 मा, उही क्षेत्रहरू अधिक तटस्थ वा सकारात्मक रूपमा चार्ज गरिएका थिए (चित्र S8e)।उदाहरणका लागि, SPACA6 मा हाइड्रोफोबिक सतह (पातलो किनाराहरू) र सकारात्मक रूपमा चार्ज गरिएका पिटहरू (फराडो किनारहरू) लाई नकारात्मक रूपमा IZUMO1 मा चार्ज गरिएको छ।
यद्यपि IZUMO1 र SPACA6 बीचको सम्बन्ध र माध्यमिक संरचना तत्वहरू राम्रोसँग संरक्षित छन्, Ig-जस्तै डोमेनहरूको संरचनात्मक पङ्क्तिबद्धताले देखायो कि दुई डोमेनहरू एकअर्काको सापेक्ष सामान्य अभिमुखीकरणमा भिन्न छन् (चित्र S9)।IZUMO1 को सर्पिल बन्डल β-स्यान्डविचको वरिपरि घुमाइएको छ, जसले केन्द्रीय अक्षबाट लगभग 50° मा पहिले वर्णन गरिएको "बुमेराङ" आकार सिर्जना गर्दछ।यसको विपरित, SPACA6 मा हेलिकल बीम विपरित दिशामा लगभग 10° झुकिएको थियो।यी अभिमुखीकरणहरूमा भिन्नताहरू काज क्षेत्रमा भिन्नताहरूको कारणले सम्भव छ।प्राथमिक अनुक्रम स्तरमा, IZUMO1 र SPACA6 ले सिस्टिन, ग्लाइसिन, र एस्पार्टिक एसिड अवशेषहरू बाहेक, काजमा थोरै अनुक्रम समानता साझा गर्दछ।नतिजाको रूपमा, हाइड्रोजन बन्ड र इलेक्ट्रोस्टेटिक नेटवर्कहरू पूर्ण रूपमा फरक छन्।β-पाना माध्यमिक संरचना तत्वहरू IZUMO1 र SPACA6 द्वारा साझा गरिएको छ, यद्यपि IZUMO1 मा चेनहरू धेरै लामो छन् र 310 हेलिक्स (हेलिक्स 5) SPACA6 को लागि अद्वितीय छ।यी भिन्नताहरूले दुई अन्यथा समान प्रोटीनहरूको लागि फरक डोमेन अभिमुखीकरणमा परिणाम दिन्छ।
हाम्रो Dali सर्भर खोजले पत्ता लगायो कि SPACA6 र IZUMO1 मात्र दुई प्रायोगिक रूपमा निर्धारित संरचनाहरू प्रोटीन डाटाबेसमा भण्डारण गरिएका छन् जसमा यो विशेष 4HB फोल्ड (तालिका S1) छ।हालैमा, DeepMind (Alphabet/Google) ले AlphaFold को विकास गरेको छ, एक तंत्रिका सञ्जाल आधारित प्रणाली जसले प्राथमिक अनुक्रम ४८ बाट प्रोटिनको थ्रीडी संरचनाको सही भविष्यवाणी गर्न सक्छ।हामीले SPACA6 संरचना समाधान गरेको केही समय पछि, AlphaFold डाटाबेस जारी गरियो, जसले मानव प्रोटोम ४८,४९ मा सबै प्रोटिनहरूको ९८.५% कभर गर्ने भविष्यवाणी संरचना मोडेलहरू प्रदान गर्‍यो।हाम्रो समाधान गरिएको SPACA6 संरचनालाई खोज मोडेलको रूपमा प्रयोग गर्दै, AlphaFold मानव प्रोटोममा SPACA6 र IZUMO1 सँग सम्भावित संरचनात्मक समानता भएका उम्मेद्वारहरूलाई पहिचान गरिएको मोडेलको लागि संरचनात्मक समरूपता खोज।SPACA6 (Fig. S10a) - विशेष गरी 1.1 Å rms ectodomain को हाम्रो समाधान गरिएको संरचना (Fig. S10b) को तुलनामा भविष्यवाणी गर्नमा AlphaFold को अविश्वसनीय सटीकता दिईएको छ - हामी पहिचान गरिएका SPACA6 मिलानहरू सही हुने सम्भावना छ भनी विश्वस्त हुन सक्छौं।
पहिले, PSI-BLAST ले तीन अन्य शुक्राणु-सम्बद्ध प्रोटिनहरू सहित IZUMO1 क्लस्टर खोजेको थियो: IZUMO2, IZUMO3, र IZUMO450।अल्फाफोल्डले भविष्यवाणी गर्‍यो कि यी IZUMO परिवार प्रोटीनहरू 4HB डोमेनमा IZUMO1 (चित्र 3a र S11) जस्तै समान डाइसल्फाइड बन्ड ढाँचामा फोल्ड हुन्छन्, यद्यपि तिनीहरूसँग Ig-जस्तो डोमेनको अभाव छ।यो परिकल्पना गरिएको छ कि IZUMO2 र IZUMO3 IZUMO1 जस्तै एक-पक्षीय झिल्ली प्रोटीनहरू हुन्, जबकि IZUMO4 स्रावित देखिन्छ।गेमेट फ्युजनमा IZUMO 2, 3, र 4 प्रोटीनहरूको कार्यहरू निर्धारण गरिएको छैन।IZUMO3 लाई शुक्राणु विकासको क्रममा एक्रोसोम बायोजेनेसिसमा भूमिका खेल्न जानिन्छ51 र IZUMO प्रोटीनले जटिल 50 गठन गरेको पाइयो।स्तनधारी, सरीसृप र उभयचरहरूमा IZUMO प्रोटिनहरूको संरक्षणले सुझाव दिन्छ कि तिनीहरूको सम्भावित कार्य अन्य ज्ञात गेमेट-फ्युजन-सम्बद्ध प्रोटीनहरू जस्तै DCST1/2, SOF1, र FIMP सँग मिल्दोजुल्दो छ।
IST सुपरफैमिलीको डोमेन आर्किटेक्चरको रेखाचित्र, क्रमशः सुन्तला, हरियो र नीलोमा हाइलाइट गरिएका 4HB, काज, र Ig-जस्तो डोमेनहरू।IZUMO4 सँग एक अद्वितीय C-टर्मिनल क्षेत्र छ जुन कालो देखिन्छ।पुष्टि गरिएको र पुटेटिभ डाइसल्फाइड बन्डहरू क्रमशः ठोस र डटेड लाइनहरूद्वारा देखाइन्छ।b IZUMO1 (PDB: 5F4E), SPACA6, IZUMO2 (AlphaFold DB: AF-Q6UXV1-F1), IZUMO3 (AlphaFold DB: AF-Q5VZ72-F1), IZUMO4 (अल्फाफोल्ड DB: AF-Q1ZYLF1-F1), र AlphaFold-5 DB: AF-Q1ZYL8-F1) : AF-Q1ZYL8-F1) : AF-Q3KNT9-F1) प्यानल A जस्तै रङ दायरामा देखाइन्छ। डाइसल्फाइड बन्डहरू म्याजेन्टामा देखाइन्छ।TMEM95, IZUMO2 र IZUMO3 transmembrane helices देखाइएको छैन।
IZUMO प्रोटिनको विपरीत, अन्य SPACA प्रोटीनहरू (जस्तै, SPACA1, SPACA3, SPACA4, SPACA5, र SPACA9) SPACA6 (चित्र S12) भन्दा संरचनात्मक रूपमा फरक मानिन्छन्।केवल SPACA9 सँग 4HB छ, तर यसमा समानान्तर-विरोधी-समानान्तर अभिविन्यास वा SPACA6 को रूपमा समान डाइसल्फाइड बन्ड हुने अपेक्षा गरिएको छैन।केवल SPACA1 सँग समान Ig-जस्तो डोमेन छ।अल्फाफोल्डले भविष्यवाणी गर्छ कि SPACA3, SPACA4 र SPACA5 को SPACA6 भन्दा पूर्ण रूपमा फरक संरचना छ।चाखलाग्दो कुरा के छ भने, SPACA4 लाई निषेचनमा भूमिका खेल्नको लागि पनि चिनिन्छ, तर SPACA6 भन्दा धेरै हदसम्म, शुक्राणु र oocyte zona pellucida52 बीचको अन्तरक्रियालाई सहज बनाउँदै।
हाम्रो AlphaFold खोजले IZUMO1 र SPACA6 4HB, TMEM95 को लागि अर्को मिल्दो फेला पार्यो।TMEM95, एक एकल शुक्राणु-विशिष्ट ट्रान्समेम्ब्रेन प्रोटीन, 32,33 घटाउँदा पुरुष मुसाहरूलाई बाँझो बनाउँछ।TMEM95 को अभाव भएको स्पर्मेटोजोआमा सामान्य आकारविज्ञान, गतिशीलता, र जोना पेलुसिडा प्रवेश गर्ने र अण्डाको झिल्लीमा बाँध्ने क्षमता थियो, तर oocyte झिल्लीसँग फ्युज गर्न सकेन।अघिल्लो अध्ययनहरूले देखाएको छ कि TMEM95 ले IZUMO133 सँग संरचनात्मक समानताहरू साझा गर्दछ।वास्तवमा, अल्फाफोल्ड मोडेलले पुष्टि गर्‍यो कि TMEM95 एक 4HB हो जसमा IZUMO1 र SPACA6 को समान जोडी CXXC मोटिफहरू छन् र SPACA6 (चित्र 3a र S11) मा पाइने हेलीस 1 र 2 बीचको समान अतिरिक्त डाइसल्फाइड बन्धन।यद्यपि TMEM95 सँग Ig-जस्तो डोमेन छैन, यसमा SPACA6 र IZUMO1 काज क्षेत्रहरू जस्तै डाइसल्फाइड बन्ड ढाँचा भएको क्षेत्र छ (चित्र 3b)।यस पाण्डुलिपिको प्रकाशनको समयमा, प्रिप्रिन्ट सर्भरले TMEM95 को संरचना रिपोर्ट गर्‍यो, AlphaFold53 परिणाम पुष्टि गर्दै।TMEM95 SPACA6 र IZUMO1 सँग धेरै मिल्दोजुल्दो छ र विकासवादी रूपमा पहिले नै उभयचरहरूमा संरक्षित छ (चित्र 4 र S13)।
PSI-BLAST खोजले जीवनको रूखमा यी अनुक्रमहरूको स्थिति निर्धारण गर्न NCBI SPACA6, IZUMO1-4, TMEM95, DCST1, DCST2, FIMP, र SOF1 डाटाबेसहरू प्रयोग गर्‍यो।शाखा बिन्दुहरू बीचको दूरी मापन गर्न देखाइएको छैन।
SPACA6 र IZUMO1 बीचको उल्लेखनीय समग्र संरचनात्मक समानताले सुझाव दिन्छ कि तिनीहरू TMEM95 र IZUMO 2, 3, र 4 प्रोटीनहरू समावेश गर्ने संरक्षित संरचनात्मक सुपरपरिवारका संस्थापक सदस्य हुन्।ज्ञात सदस्यहरू: IZUMO1, SPACA6 र TMEM95।केवल केही सदस्यहरूसँग Ig-जस्तै डोमेनहरू भएकाले, IST सुपरफैमिलीको विशेषता भनेको 4HB डोमेन हो, जसमा यी सबै प्रोटीनहरूमा सामान्य विशेषताहरू छन्: 1) एन्टी-समानान्तर/समानान्तर एकान्तरण (चित्र . 5a), 2) बन्डलको बन्डल भित्र दुईवटा हेलिक्स र तेस्रो ठाडो हेलिक्स (चित्र कुञ्जी क्षेत्र (चित्र 5c) सम्मिलित त्रिकोणात्मक अनुहार हुन्छ। thioredoxin-जस्तो प्रोटीनमा पाइने CXXC मोटिफ, कार्य गर्न जानिन्छ। रेडक्स सेन्सर 54,55,56 को रूपमा, जबकि IST परिवारका सदस्यहरूमा मोटिफलाई ग्यामेट फ्यूजनमा ERp57 जस्ता प्रोटिन डाइसल्फाइड आइसोमेरेसहरूसँग सम्बन्धित हुन सक्छ। भूमिकाहरू 57,58 सम्बन्धित छन्।
IST सुपरफैमिलीका सदस्यहरूलाई 4HB डोमेनका तीन विशेषताहरूद्वारा परिभाषित गरिएको छ: समानान्तर र एन्टिपैरलल अभिविन्यास, बा-त्रिकोणीय हेलिकल बन्डल फेसहरू, र साना अणुहरू बीचको ca CXXC डबल मोटिफको बीचमा एकान्तरण गर्ने चार हेलीसहरू।) एन-टर्मिनल हेलिक्स (सुन्तला) र काज क्षेत्र β-हेयरपिन (हरियो)।
SPACA6 र IZUMO1 बीचको समानतालाई ध्यानमा राख्दै, पूर्वको IZUMO1 वा JUNO मा बाँध्न सक्ने क्षमता परीक्षण गरिएको थियो।बायोलेयर इन्टरफेरोमेट्री (BLI) एक काइनेटिक-आधारित बाध्यकारी विधि हो जुन पहिले IZUMO1 र JUNO बीचको अन्तरक्रिया परिमाण गर्न प्रयोग गरिएको थियो।JUNO विश्लेषकको उच्च एकाग्रताको साथ चाराको रूपमा IZUMO1 सँग बायोटिन-लेबल गरिएको सेन्सरको इन्क्युबेशन पछि, सेन्सर टिपमा संलग्न बायोमटेरियलको मोटाईमा बाध्यकारी-प्रेरित परिवर्तनलाई सङ्केत गर्दै एउटा बलियो संकेत (चित्र S14a) पत्ता लाग्यो।समान संकेतहरू (अर्थात्, IZUMO1 विश्लेषक विरुद्ध चाराको रूपमा JUNO सेन्सरमा जोडिएको) (चित्र S14b)।SPACA6 लाई सेन्सर-बाउन्ड IZUMO1 वा सेन्सर-बाउन्ड JUNO (चित्र S14a,b) विरुद्ध विश्लेषकको रूपमा प्रयोग गर्दा कुनै संकेत भेटिएन।यस संकेतको अनुपस्थितिले संकेत गर्दछ कि SPACA6 को बाह्य सेलुलर डोमेनले IZUMO1 वा JUNO को एक्स्ट्रासेलुलर डोमेनसँग अन्तरक्रिया गर्दैन।
किनभने BLI परख चारा प्रोटीनमा नि: शुल्क लाइसिन अवशेषहरूको बायोटिनाइलेशनमा आधारित छ, यदि लाइसिन अवशेषहरू अन्तरक्रियामा संलग्न छन् भने यो परिमार्जनले बाध्यकारी रोक्न सक्छ।थप रूपमा, सेन्सरसँग सम्बन्धित बाइन्डिङको अभिमुखीकरणले स्टेरिक बाधाहरू सिर्जना गर्न सक्छ, त्यसैले परम्परागत पुल-डाउन एसेहरू पनि पुन: संयोजक SPACA6, IZUMO1 र JUNO ectodomains मा प्रदर्शन गरिएको थियो।यसका बावजुद, SPACA6 ले His-tagged IZUMO1 वा His-tagged JUNO (Fig. S14c,d) सँग प्रक्षेपण गरेन, BLI प्रयोगहरूमा अवलोकन गरिएको कुनै अन्तरक्रियासँग मेल खाँदैन।सकारात्मक नियन्त्रणको रूपमा, हामीले JUNO को उनको IZUMO1 (चित्र S14e र S15) लेबलको साथ अन्तरक्रिया पुष्टि गर्यौं।
SPACA6 र IZUMO1 बीचको संरचनात्मक समानताको बाबजुद, SPACA6 को JUNO बाँध्न असक्षम हुनु अचम्मको कुरा होइन।मानव IZUMO1 को सतहमा 20 भन्दा बढी अवशेषहरू छन् जुन JUNO सँग अन्तरक्रिया गर्दछ, जसमा प्रत्येक तीन क्षेत्रका अवशेषहरू छन् (यद्यपि तीमध्ये धेरैजसो काज क्षेत्रमा अवस्थित छन्) (चित्र S14f)।यी अवशेषहरू मध्ये, केवल एक SPACA6 (Glu70) मा संरक्षित छ।जबकि धेरै अवशेष प्रतिस्थापनहरूले तिनीहरूको मौलिक जैव रासायनिक गुणहरू कायम राखे, IZUMO1 मा आवश्यक Arg160 अवशेषहरू SPACA6 मा नकारात्मक रूपमा चार्ज गरिएको Asp148 द्वारा प्रतिस्थापित गरियो;अघिल्लो अध्ययनहरूले देखाएको छ कि IZUMO1 मा Arg160Glu उत्परिवर्तनले JUNO43 लाई लगभग पूर्ण रूपमा समाप्त गर्छ।थप रूपमा, IZUMO1 र SPACA6 बीचको डोमेन अभिमुखीकरणमा भिन्नताले SPACA6 (Fig. S14g) मा बराबर क्षेत्रको JUNO-बाइंडिंग साइटको सतह क्षेत्रलाई उल्लेखनीय रूपमा बढायो।
गेमेट फ्युजनको लागि SPACA6 को ज्ञात आवश्यकता र IZUMO1 सँग यसको समानताको बाबजुद, SPACA6 सँग बराबर JUNO बाध्यकारी प्रकार्य देखिँदैन।त्यसकारण, हामीले हाम्रो संरचनात्मक डेटालाई विकासवादी जीवविज्ञानले उपलब्ध गराएको महत्त्वको प्रमाणसँग जोड्न खोजेका छौं।SPACA6 homologues को अनुक्रम पङ्क्तिबद्धता स्तनधारी भन्दा बाहिर साझा संरचना को संरक्षण देखाउँछ।उदाहरणका लागि, सिस्टिन अवशेषहरू टाढा सम्बन्धित उभयचरहरूमा पनि उपस्थित हुन्छन् (चित्र 6a)।ConSurf सर्भर प्रयोग गरेर, 66 अनुक्रमहरूको बहु अनुक्रम पङ्क्तिबद्धता अवधारण डेटा SPACA6 सतहमा म्याप गरियो।यस प्रकारको विश्लेषणले देखाउन सक्छ कि कुन अवशेषहरू प्रोटीन विकासको क्रममा संरक्षित गरिएको छ र कुन सतह क्षेत्रहरूले कार्यमा भूमिका खेल्छन् भनेर संकेत गर्न सक्छ।
CLUSTAL OMEGA प्रयोग गरी तयार पारिएको १२ विभिन्न प्रजातिहरूबाट SPACA6 ectodomains को अनुक्रम पङ्क्तिबद्धता।ConSurf विश्लेषण अनुसार, सबैभन्दा रूढिवादी स्थितिहरू नीलोमा चिन्ह लगाइएका छन्।सिस्टिन अवशेषहरू रातोमा हाइलाइट गरिएका छन्।डोमेन सीमाहरू र माध्यमिक संरचना तत्वहरू पङ्क्तिबद्धताको शीर्षमा देखाइन्छ, जहाँ तीरहरूले β-स्ट्र्यान्डहरू र तरंगहरूले हेलिकेसहरू संकेत गर्छन्।अनुक्रमहरू समावेश गर्ने NCBI पहुँच पहिचानकर्ताहरू हुन्: मानव (होमो सेपियन्स, NP_001303901), म्यानड्रिल (Mandrilus leucophaeus, XP_011821277), क्यापुचिन बाँदर (सेबस नक्कल, XP_0173599, XP_017359903, caballer, XP_01735903601, घोडा 2013603601), घोडा ह्वेल (Orcinus orca3_23 XP_032_034)।), भेडा (Ovis aries, XP_014955560), हात्ती (Loxodonta africana, XP_010585293), कुकुर (Canis lupus familyis, XP_025277208), माउस (Mus musculus, NP_001155560), XP_0015638 611, XP_0318), Platypus, 8) , 61_89 र Bullfrog (Bufo bufo, XP_040282113)।संख्या मानव क्रम मा आधारित छ।b शीर्षमा 4HB र तल Ig-जस्तो डोमेनको साथ SPACA6 संरचनाको सतह प्रतिनिधित्व, ConSurf सर्भरबाट संरक्षण अनुमानहरूमा आधारित रंगहरू।सबै भन्दा राम्रो संरक्षित भागहरू नीलोमा छन्, मध्यम रूपमा संरक्षित भागहरू सेतोमा छन्, र सबैभन्दा कम संरक्षित भागहरू पहेंलोमा छन्।बैजनी सिस्टीन।उच्च स्तरको सुरक्षा देखाउने तीनवटा सतह प्याचहरू इनसेट लेबल गरिएको प्याच १, २ र ३ मा देखाइएको छ। 4HB कार्टुन शीर्ष दायाँ (उही रङ योजना) मा इनसेटमा देखाइएको छ।
SPACA6 संरचनामा तीन उच्च संरक्षित सतह क्षेत्रहरू छन् (चित्र 6b)।प्याच 1 ले 4HB र काज क्षेत्रलाई फैलाउँछ र दुई संरक्षित CXXC डाइसल्फाइड ब्रिजहरू समावेश गर्दछ, एउटा Arg233-Glu132-Arg135-Ser144 हिङ्ग नेटवर्क (Fig. S7), र तीन संरक्षित बाहिरी सुगन्धित अवशेषहरू (Phe31, Tyr137, Phe31)।Ig-like डोमेन (Fig. S6e) को फराकिलो रिम, जसले शुक्राणु सतहमा धेरै सकारात्मक चार्ज गरिएका अवशेषहरूलाई प्रतिनिधित्व गर्दछ।चाखलाग्दो कुरा के छ भने, यो प्याचमा एन्टिबडी एपिटोप समावेश छ जुन पहिले SPACA6 30 प्रकार्यमा हस्तक्षेप गर्न देखाइएको छ।क्षेत्र 3 ले काज र Ig-जस्तो डोमेनको एक छेउमा फैलिएको छ;यस क्षेत्रले संरक्षित प्रोलाइनहरू (Pro126, Pro127, Pro150, Pro154) र बाहिरी-फेसिङ ध्रुवीय/चार्ज गरिएका अवशेषहरू समावेश गर्दछ।आश्चर्यजनक रूपमा, 4HB को सतहमा धेरै अवशेषहरू उच्च परिवर्तनशील छन् (चित्र 6b), यद्यपि तह SPACA6 homologue (जस्तै हाइड्रोफोबिक बन्डल कोरको रूढ़िवादीताद्वारा संकेत गरिएको छ) र IST सुपरफैमिली बाहिर सुरक्षित गरिएको छ।
यद्यपि यो थोरै पत्ता लगाउन सकिने माध्यमिक संरचना तत्वहरूसँग SPACA6 मा सबैभन्दा सानो क्षेत्र हो, धेरै काज क्षेत्र अवशेषहरू (क्षेत्र 3 सहित) SPACA6 homologues बीच अत्यधिक संरक्षित छन्, जसले हेलिकल बन्डल र β-sandwich को अभिमुखीकरणले भूमिका खेल्छ भनेर संकेत गर्न सक्छ।एक रूढ़िवादी रूपमा।यद्यपि, SPACA6 र IZUMO1 को काज क्षेत्रमा व्यापक हाइड्रोजन बन्धन र इलेक्ट्रोस्टेटिक नेटवर्कहरूको बावजुद, IZUMO137,43,44 को बहु अनुमति संरचनाहरूको पङ्क्तिबद्धतामा आन्तरिक लचिलोपनको प्रमाण देख्न सकिन्छ।व्यक्तिगत डोमेनहरूको पङ्क्तिबद्धता राम्रोसँग ओभरल्याप भयो, तर एकअर्कासँग सम्बन्धित डोमेनहरूको अभिमुखीकरण केन्द्रीय अक्ष (चित्र S16) बाट 50° देखि 70° सम्म भिन्न थियो।समाधानमा SPACA6 को संरचनात्मक गतिशीलता बुझ्नको लागि, SAXS प्रयोगहरू प्रदर्शन गरियो (चित्र S17a, b)।SPACA6 ectodomain को प्रारम्भिक पुनर्निर्माण रड क्रिस्टल संरचना (Fig. S18) मा अनुरूप छ, यद्यपि Kratky कथानकले केही हदसम्म लचिलोपन देखाएको छ (चित्र S17b)।यो कन्फर्मेसन IZUMO1 सँग विपरित छ, जसमा अनबाउन्ड प्रोटिनले जाली र समाधानमा बूमेराङ आकार धारण गर्दछ।
विशेष रूपमा लचिलो क्षेत्र पहिचान गर्न, हाइड्रोजन-ड्युटेरियम एक्सचेन्ज मास स्पेक्ट्रोस्कोपी (H-DXMS) SPACA6 मा प्रदर्शन गरिएको थियो र पहिले IZUMO143 (चित्र 7a,b) मा प्राप्त गरिएको डेटासँग तुलना गरिएको थियो।SPACA6 स्पष्ट रूपमा IZUMO1 भन्दा बढी लचिलो छ, जसरी 100,000 s विनिमय पछि संरचनामा उच्च ड्यूटेरियम एक्सचेन्जले प्रमाणित गरेको छ।दुबै संरचनाहरूमा, काज क्षेत्रको C-टर्मिनल भागले उच्च स्तरको विनिमय देखाउँछ, जसले सम्भवतः 4HB र Ig-जस्तै डोमेनहरूलाई एकअर्काको सापेक्ष सीमित परिक्रमा गर्न अनुमति दिन्छ।चाखलाग्दो कुरा के छ भने, 147CDLPLDCP154 अवशेषहरू समावेश गरी SPACA6 काजको C-टर्मिनल भाग, एक उच्च संरक्षित क्षेत्र 3 (चित्र 6b) हो, सम्भवतः अन्तर डोमेन लचिलोपन SPACA6 को विकासात्मक रूपमा संरक्षित विशेषता हो भनेर संकेत गर्दछ।लचिलोपन विश्लेषणका अनुसार, CD थर्मल मेल्ट डेटाले SPACA6 (Tm = 51.2°C) IZUMO1 (Tm = 62.9°C) (Fig. S1e र S19) भन्दा कम स्थिर रहेको देखाएको छ।
SPACA6 र b IZUMO1 को H-DXMS छविहरू।प्रतिशत ड्युटेरियम विनिमय संकेत गरिएको समय बिन्दुहरूमा निर्धारण गरिएको थियो।हाइड्रोजन-ड्युटेरियम एक्सचेन्जको स्तरहरू नीलो (10%) देखि रातो (90%) सम्म ग्रेडियन्ट स्केलमा रंगद्वारा संकेत गरिन्छ।ब्ल्याक बक्सले उच्च विनिमय क्षेत्रहरू प्रतिनिधित्व गर्दछ।क्रिस्टल संरचनामा 4HB, काज र Ig-जस्तो डोमेनको सीमाहरू प्राथमिक अनुक्रम माथि देखाइएको छ।10 s, 1000 s, र 100,000 s मा ड्युटेरियम विनिमय स्तरहरू SPACA6 र IZUMO1 को पारदर्शी आणविक सतहहरूमा सुपरइम्पोज गरिएको स्ट्रिप चार्टमा प्लट गरिएको थियो।५०% भन्दा कम ड्युटेरियम एक्सचेन्ज लेभल भएका संरचनाका भागहरू सेतो रङका हुन्छन्।50% H-DXMS एक्सचेन्ज भन्दा माथिका क्षेत्रहरू ग्रेडियन्ट स्केलमा रंगीन हुन्छन्।
CRISPR/Cas9 र माउस जीन नकआउट आनुवंशिक रणनीतिहरूको प्रयोगले शुक्राणु र अण्डा बाइन्डिङ र फ्युजनको लागि महत्त्वपूर्ण कारकहरूको पहिचान गर्न नेतृत्व गरेको छ।IZUMO1-JUNO र CD9 संरचनाको राम्रो-विशेष अन्तरक्रिया बाहेक, गेमेट फ्यूजनसँग सम्बन्धित अधिकांश प्रोटीनहरू संरचनात्मक र कार्यात्मक रूपमा रहस्यमय रहन्छन्।SPACA6 को बायोफिजिकल र संरचनात्मक विशेषता निषेचन समयमा आसंजन/फ्यूजन आणविक पजलको अर्को टुक्रा हो।
SPACA6 र IST का अन्य सदस्यहरू स्तनपायीहरूका साथै व्यक्तिगत चराहरू, सरीसृपहरू र उभयचरहरूमा उच्च रूपमा संरक्षित देखिन्छन्;वास्तवमा, यो मानिन्छ कि SPACA6 पनि zebrafish 59 मा निषेचन गर्न आवश्यक छ। यो वितरण अन्य ज्ञात गेमेट फ्यूजन-सम्बद्ध प्रोटीनहरू जस्तै DCST134, DCST234, FIMP31, र SOF132 जस्तै छ, यी कारकहरू HAP2-कमजोरी छन् भनेर सुझाव दिन्छ। GCS1 को रूपमा चिनिन्छ) प्रोटीनहरू जुन धेरै प्रोटिस्टहरूको उत्प्रेरक गतिविधिको लागि जिम्मेवार हुन्छन्।, बिरुवाहरू, र आर्थ्रोपोडहरू।निषेचित फ्युजन प्रोटीनहरू 60, 61. SPACA6 र IZUMO1 बीचको बलियो संरचनात्मक समानताको बावजुद, यी मध्ये कुनै पनि प्रोटिनलाई एन्कोड गर्ने जीनको नकआउटले नर मुसामा बाँझोपन निम्त्यायो, यसले ग्यामेट फ्यूजनमा तिनीहरूको कार्यहरू नक्कल गरिएको छैन भनेर संकेत गर्छ।।अझ व्यापक रूपमा, फ्युजनको आसंजन चरणको लागि आवश्यक ज्ञात शुक्राणु प्रोटीनहरू मध्ये कुनै पनि अनावश्यक छैन।
यो खुला प्रश्न रहन्छ कि SPACA6 (र IST सुपरफैमिलीका अन्य सदस्यहरू) अन्तर्गामेटिक जंक्शनहरूमा भाग लिन्छन्, फ्युजन बिन्दुहरूमा महत्त्वपूर्ण प्रोटिनहरू भर्ती गर्न इन्ट्रागामेटिक नेटवर्कहरू बनाउँछन्, वा सायद मायावी फ्यूजेन्सको रूपमा कार्य गर्छन्।HEK293T कोशिकाहरूमा सह-इम्युनोप्रेसिपिटेशन अध्ययनले पूर्ण लम्बाइ IZUMO1 र SPACA632 बीचको अन्तरक्रिया प्रकट गर्‍यो।यद्यपि, हाम्रो पुन: संयोजक इक्टोडोमेनहरूले भिट्रोमा अन्तरक्रिया गरेनन्, सुझाव दिन्छ कि नोडा एट अलमा देखिएको अन्तरक्रियाहरू।दुवैलाई निर्माणमा मेटाइएको थियो (IZUMO1 को साइटोप्लाज्मिक पुच्छरलाई ध्यान दिनुहोस्, जुन निषेचनका लागि अनावश्यक देखाइएको छ)।वैकल्पिक रूपमा, IZUMO1 र/वा SPACA6 लाई हामीले भिट्रोमा पुन: उत्पादन नगर्ने विशिष्ट बाध्यकारी वातावरणहरू आवश्यक पर्न सक्छ, जस्तै शारीरिक रूपमा विशिष्ट संरचनाहरू वा अन्य प्रोटीनहरू (ज्ञात वा अझै पत्ता नलागेको) समावेश गर्ने आणविक परिसरहरू।यद्यपि IZUMO1 ectodomain ले पेरिभिटेललाइन स्पेसमा अण्डामा शुक्राणुको संलग्नताको मध्यस्थता गर्ने विश्वास गरिन्छ, SPACA6 ectodomain को उद्देश्य स्पष्ट छैन।
SPACA6 को संरचनाले धेरै संरक्षित सतहहरू प्रकट गर्दछ जुन प्रोटीन-प्रोटिन अन्तरक्रियामा संलग्न हुन सक्छ।CXXC मोटिफ (माथि तोकिएको प्याच १) सँग तुरुन्तै छेउछाउको काज क्षेत्रको संरक्षित भागमा धेरै बाहिरी-फेसिङ सुगन्धित अवशेषहरू छन् जुन प्रायः बायोमोलिक्युलहरू बीच हाइड्रोफोबिक र π-स्ट्याकिंग अन्तरक्रियासँग सम्बन्धित हुन्छन्।Ig-जस्तै डोमेन (क्षेत्र 2) को फराकिलो पक्षहरूले उच्च संरक्षित Arg र उहाँका अवशेषहरूको साथ सकारात्मक रूपमा चार्ज गरिएको ग्रूभ बनाउँछ, र यस क्षेत्र विरुद्ध एन्टिबडीहरू पहिले गेमेट फ्यूजन 30 ब्लक गर्न प्रयोग गरिएको थियो।एन्टिबडीले रैखिक एपिटोप 212RIRPQLTHRGTFS225 लाई पहिचान गर्दछ, जसमा छ वटा आर्गिनिन अवशेषहरू मध्ये तीन छन् र His220 लाई उच्च रूपमा संरक्षित गरिएको छ।यो डिसफंक्शन यी विशिष्ट अवशेषहरूको अवरोध वा सम्पूर्ण क्षेत्रको अवरोधको कारण हो कि भनेर स्पष्ट छैन।β-स्यान्डविचको C-टर्मिनस नजिकको यो अन्तरको स्थानले छिमेकी शुक्राणु प्रोटीनहरूसँग cis-अन्तर्क्रियालाई संकेत गर्छ, तर oocyte प्रोटीनहरूसँग होइन।यसबाहेक, काज भित्र अत्यधिक लचिलो प्रोलाइन-रिच ट्याङ्गल (साइट 3) को अवधारण प्रोटीन-प्रोटिन अन्तरक्रियाको साइट हुन सक्छ वा, सम्भवतः, दुई डोमेनहरू बीच लचिलोपनको अवधारणलाई संकेत गर्दछ।SPACA6 को अज्ञात भूमिकाको लागि लिङ्ग महत्त्वपूर्ण छ।gametes को फ्यूजन।
SPACA6 सँग Ig-like β-sandwiches सहित इन्टरसेलुलर आसंजन प्रोटीनहरूको गुणहरू छन्।धेरै टाँस्ने प्रोटीनहरू (जस्तै, क्याडेरिन्स, इन्टिग्रिनहरू, एडेसिनहरू, र IZUMO1) एक वा बढी β-स्यान्डविच डोमेनहरू हुन्छन् जसले कोष झिल्लीबाट प्रोटीनहरूलाई तिनीहरूको वातावरणीय लक्ष्यहरूमा विस्तार गर्दछ।SPACA6 को Ig-जस्तै डोमेनमा सामान्यतया β-स्यान्डविचमा पाइने आसंजन र एकता: β-स्यान्डविचको छेउमा समानान्तर स्ट्र्यान्डहरूको डबल्स, मेकानिकल क्ल्याम्प्स66 भनिन्छ।यो मानिन्छ कि यो आकृतिले कतरनी बलहरूमा प्रतिरोध बढाउँछ, जुन इन्टरसेलुलर अन्तरक्रियामा संलग्न प्रोटीनहरूको लागि मूल्यवान छ।यद्यपि, एडेसिनहरूसँग यो समानताको बावजुद, त्यहाँ हाल कुनै प्रमाण छैन कि SPACA6 अन्डाको सेतोसँग अन्तरक्रिया गर्दछ।SPACA6 ectodomain ले JUNO मा बाँध्न असमर्थ छ, र SPACA6- व्यक्त गर्ने HEK293T कोशिकाहरू, यहाँ देखाइए अनुसार, zona 32 को अभावमा oocytes सँग अन्तर्क्रिया गर्दैन।यदि SPACA6 ले अन्तरक्रियात्मक बन्धनहरू स्थापना गर्छ भने, यी अन्तरक्रियाहरूलाई पोस्ट-अनुवादात्मक परिमार्जनहरू आवश्यक पर्दछ वा अन्य शुक्राणु प्रोटीनहरूद्वारा स्थिर हुन सक्छ।पछिल्लो परिकल्पनाको समर्थनमा, IZUMO1-कम शुक्रकीटले oocytes मा बाँध्छ, IZUMO1 बाहेक अन्य अणुहरू गेमेट आसंजन चरण 27 मा संलग्न छन् भनेर देखाउँदछ।
धेरै भाइरल, सेलुलर, र विकासात्मक फ्यूजन प्रोटीनहरूमा गुणहरू छन् जसले फ्युसोजेन्सको रूपमा तिनीहरूको कार्यको भविष्यवाणी गर्दछ।उदाहरणका लागि, भाइरल फ्यूजन ग्लाइकोप्रोटिनहरू (कक्षा I, II र III) मा हाइड्रोफोबिक फ्यूजन पेप्टाइड वा प्रोटिनको अन्त्यमा लूप हुन्छ जुन होस्ट झिल्लीमा घुसाइन्छ।IZUMO143 को हाइड्रोफिलिसिटी नक्सा र IST को संरचना (निर्धारित र भविष्यवाणी गरिएको) सुपरफैमिलीले कुनै स्पष्ट हाइड्रोफोबिक फ्यूजन पेप्टाइड देखाएको छैन।यसरी, यदि IST मा कुनै पनि प्रोटिनले फ्युसोजेन्सको रूपमा सुपरफैमिली कार्य गर्दछ भने, तिनीहरू अन्य ज्ञात उदाहरणहरू भन्दा फरक तरिकाले गर्छन्।
निष्कर्षमा, गेमेट फ्यूजनसँग सम्बन्धित प्रोटीनहरूको IST सुपरफैमिलीका सदस्यहरूको कार्यहरू एक ट्यान्टलाइजिंग रहस्य बनी रहन्छ।हाम्रो विशेषतायुक्त SPACA6 पुन: संयोजक अणु र यसको समाधान गरिएको संरचनाले यी साझा संरचनाहरू र गेमेट एट्याचमेन्ट र फ्युजनमा तिनीहरूको भूमिका बीचको सम्बन्धमा अन्तरदृष्टि प्रदान गर्नेछ।
अनुमानित मानव SPACA6 इक्टोडोमेन (NCBI एक्सेस नम्बर NP_001303901.1; अवशेषहरू 27-246) सँग सम्बन्धित DNA अनुक्रम ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर S2 कोशिकाहरूमा अभिव्यक्तिको लागि कोडोन-अनुकूलित गरिएको थियो र जीन कोफिनोक्सोक्नोजिक गेन्सोक्नोजामिकको रूपमा संश्लेषित गरिएको थियो।, BiP स्राव संकेत र सम्बन्धित 5′ र 3′ यस जीनको ligation-स्वतन्त्र क्लोनिंगको लागि pMT अभिव्यक्ति भेक्टरमा puromycin (pMT-puro) को साथ चयनको लागि परिमार्जन गरिएको Metallothionein प्रमोटरमा आधारित हुन्छ।pMT-puro भेक्टरले 10x-His C-terminal ट्याग (चित्र S2) पछि थ्रोम्बिन क्लीभेज साइटलाई सङ्केत गर्छ।
D. melanogaster S2 (Gibco) कोशिकाहरूमा SPACA6 pMT-puro भेक्टरको स्थिर ट्रान्सफेक्सन IZUMO1 र JUNO43 को लागि प्रयोग गरिएको प्रोटोकल जस्तै गरीएको थियो।S2 कोशिकाहरू स्नाइडरको माध्यम (Gibco) मा 10% (v/v) गर्मी-निष्क्रिय भ्रूण बाछो सीरम (Gibco) र 1X एन्टिमाइकोटिक एन्टिबायोटिक (Gibco) को अन्तिम एकाग्रताको साथ पूरकमा पग्लिएर हुर्काइयो।प्रारम्भिक मार्ग कक्षहरू (3.0 x 106 कक्षहरू) 6-वेल प्लेटहरू (कोर्निङ) को व्यक्तिगत इनारहरूमा प्लेट गरिएको थियो।27 डिग्री सेल्सियसमा इन्क्युबेशनको 24 घण्टा पछि, कोशिकाहरू निर्माताको प्रोटोकल अनुसार SPACA6 pMT-puro भेक्टर र Effectene ट्रान्सफेक्सन अभिकर्मक (Qiagen) को 2 mg को मिश्रणले रूपान्तरण गरियो।ट्रान्सफेक्टेड कोशिकाहरूलाई ७२ घण्टासम्म इन्क्युबेटेड गरियो र त्यसपछि ६ मिलीग्राम/एमएल प्युरोमाइसिनको साथ काटियो।त्यसपछि कोशिकाहरूलाई पूर्ण स्नाइडरको माध्यमबाट अलग गरियो र ठूलो मात्रामा प्रोटिन उत्पादनको लागि सीरम फ्री इन्सेक्ट-एक्सप्रेस माध्यम (लोन्जा) मा राखियो।S2 सेल कल्चरको 1 L ब्याच 8-10 × 106 ml-1 कोशिकाहरूमा 2 L भेन्टिलेट गरिएको फ्ल्याट-तलको पोलीप्रोपाइलीन एर्लेनमेयर फ्लास्कमा बढाइएको थियो र त्यसपछि 500 ​​µM CuSO4 (Millipor Sigma) र बाँझ फिल्टरको अन्तिम एकाग्रताको साथ बाँझिएको थियो।प्रेरित।प्रेरित संस्कृतिहरू 27 डिग्री सेल्सियसमा 120 आरपीएममा चार दिनसम्म इन्क्युबेटेड थिए।
SPACA6 युक्त कन्डिसन गरिएको माध्यमलाई 5660×g मा 4°C मा सेन्ट्रीफ्युगेशनद्वारा पृथक गरिएको थियो र त्यसपछि 10 kDa MWCO झिल्लीको साथ सेन्ट्रामेट ट्यांजेन्टियल फ्लो फिल्ट्रेशन प्रणाली (पल कर्प) द्वारा।SPACA6 भएको केन्द्रित माध्यमलाई २ ml Ni-NTA agarose resin (Qiagen) स्तम्भमा लगाउनुहोस्।Ni-NTA राललाई बफर A को 10 स्तम्भ भोल्युम (CV) संग धोइयो र त्यसपछि 50 mM को अन्तिम इमिडाजोल एकाग्रता दिनको लागि बफर A को 1 CV थपियो।SPACA6 लाई 10 मिलीलीटर बफर ए इमिडाजोलको साथ 500 एमएमको अन्तिम एकाग्रतामा पूरक गरिएको थियो।प्रतिबन्ध वर्ग थ्रोम्बिन (मिलिपोर सिग्मा) डायलिसिस ट्युबिङ (MWCO 12-14 kDa) मा 1 एकाइ प्रति mg SPACA6 बनाम 1 L 10 mM Tris-HCl, pH 7.5 र 150 mM NaCl (बफर B) को लागि डायलिसिस ट्युबिङमा थपियो।४८ घण्टाको लागि ४ डिग्री सेल्सियसमा।थ्रोम्बिन-क्लिभ गरिएको SPACA6 लाई नुन सांद्रता कम गर्न तीन गुणा पातलो गरियो र 10 mM Tris-HCl, pH 7.5 सँग सन्तुलित 1 ml MonoS 5/50 GL cation विनिमय स्तम्भ (Cytiva/GE) मा लोड गरियो।क्याशन एक्सचेन्जर 10 एमएम Tris-HCl, pH 7.5 को 3 CV ले धोइयो, त्यसपछि SPACA6 लाई 10 mM Tris-HCl मा 0 देखि 500 ​​mM NaCl को रैखिक ढाँचाको साथ, 25 CV को लागि pH 7.5 बाट निकालियो।आयन एक्सचेन्ज क्रोमेटोग्राफी पछि, SPACA6 लाई 1 ml मा केन्द्रित गरिएको थियो र ENrich SEC650 10 x 300 स्तम्भ (BioRad) बाट बफर B सँग सन्तुलित गरिएको छ।शुद्धता 16% SDS-polyacrylamide जेलमा Coomassie-stained electrophoresis द्वारा नियन्त्रण गरिएको थियो।बियर-ल्याम्बर्ट कानून र सैद्धान्तिक मोलर विलुप्त गुणांक प्रयोग गरेर 280 एनएममा शोषक द्वारा प्रोटीन एकाग्रता परिमाण गरिएको थियो।
शुद्ध SPACA6 लाई 10 mM सोडियम फस्फेट, pH 7.4 र 150 mM NaF विरुद्ध रातारात डायलाइज गरियो र CD स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा विश्लेषण गर्नु अघि 0.16 mg/mL मा पातलो गरियो।185 देखि 260 nm को तरंग लम्बाइको साथ CD को स्पेक्ट्रल स्क्यानिङ 50 nm/min को दरमा 25°C मा 1 mm अप्टिकल पथ लम्बाइ (हेल्मा) को साथ क्वार्ट्ज क्युवेट्स प्रयोग गरेर Jasco J-1500 स्पेक्ट्रोपोलारिमिटरमा संकलन गरिएको थियो।CD स्पेक्ट्रा आधारभूत सुधार गरिएको थियो, 10 भन्दा बढी अधिग्रहणहरू औसत, र cm2/dmol डिग्रीमा अवशिष्ट अण्डाकार (θMRE) मा रूपान्तरण गरियो:
जहाँ MW Da मा प्रत्येक नमूनाको आणविक वजन हो;एन एमिनो एसिडको संख्या हो;θ मिलिडिग्रीमा अण्डाकार हो;d सेमीमा अप्टिकल मार्गको लम्बाइसँग मेल खान्छ;एकाइहरूमा प्रोटीन एकाग्रता।